染料木黃酮抑制血管內皮生長因子誘導的血管內皮細胞活化及蛋白激酶K活性

韓彬，程道梅，余小平＊，彭曉莉，賈皓

（1.遵義醫學院公共衛生學院，貴州 遵義 563003；2.成都醫學院公共衛生系，四川 成都 610083）

血管生成對實體瘤的生長、浸潤和轉移至關重要，血管內皮細胞（ECs）的活化和腫瘤細胞直接參與 實 體 腫 瘤 的 血 管 生 成［1－3］。 染 料 木 黃 酮（genistein，Gen）是一種重要的非營養素，屬于異黃酮類，主要存在于大豆及其制品中。目前，針對Gen的功效研究主要集中于腫瘤、心血管疾病和女性絕經綜合征的化學預防［4］。前期研究顯示，Gen在體內外均可通過抑制HER－2／neu受體磷酸化和蛋白激酶K（PTK）活性［5］下調促血管生成因子的表達，但有關Gen抗血管生成作用的分子機制仍不十分清楚。ECs參與實體腫瘤的血管生成［6］，本研究旨在評估Gen對血管內皮生長因子（VEGF）誘導的ECs活化的影響，揭示Gen抗血管生成的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

染料木黃酮、VEGF購自北京Yahui生物醫學工程公司；PTK活性分析試劑盒、Caspase－3活性分析試劑盒、Annexin V－FITC凋亡試劑盒購自美國Promega公司；特級胎牛血清購自Hyclone公司；ECs生長添加劑ECGS、抗體F－3520購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養基購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）培養和處理收集健康非異常妊娠母親經陰道所產健康胎兒的新鮮臍帶，分離 HUVECs，在含有20%特級胎牛血清、100U／ml盤 尼 西 林、100μg／ml鏈 霉 素 和75μg／ml ECGS的RPMI1640培養液中，37℃，5%CO2條件下培養。根據鵝卵石樣形態以及免疫細胞化學方法（ECs特異抗體，F－3520）鑒定為ECs。將第3～6代的細胞接種于24孔板，分別用5μg／ml VEGF單獨處理或VEGF（5μg／ml）外加1、10、100μmol／L Gen處理24h。用等量的二甲基亞楓（DMSO）替代VEGF和（或）Gen處理作為對照組。細胞培養基中DMSO的終濃度≤0.1%（v／v）。

1.2.2 細胞凋亡和死亡分析 采用Caspase－3活性分析試劑盒和Annexin V－FITC凋亡試劑盒對凋亡情況進行定量分析，通過錐蟲藍不相容試驗對HUVECs的細胞毒性和死亡情況進行量化分析。

1.2.3 PTK活性分析 將HUVECs在蛋白緩沖液中4℃下溶解20min。緩沖液組成：1%Triton X－100、0.32mol／L 蔗 糖、5mmol／L 乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA）、1mmol／L 苯 甲 基 磺 酰 氟 （PMSF）、1μg／ml抑肽酶、2mmol／L 二硫蘇 糖醇 （DTT）、10mmol／L Tris－Cl、pH 8.0。采用 Bradford方法測定蛋白的總濃度，嚴格按照PTK活性分析試劑盒說明書操作測定PTK活性，結果表示為pmol／min／μg蛋白。

2 結果

2.1 Gen誘導VEGF處理的內皮細胞凋亡和死亡

VEGF單獨使用或與DMSO聯合使用處理HUVECs 24h，其凋亡細胞死亡情況沒有明顯差異（圖1）。與對照組相比，1μmol／L Gen處理組的ECs凋亡率（圖1A）和Caspase－3活力（圖1B）分別增加了1.81和1.72倍，與VEGF處理組相比，兩者分別增加了2.01和2.02倍。Gen處理導致凋亡率（圖1A）和Caspese－3活力（圖1B）呈劑量依賴型提高，提示Gen可誘導ECs凋亡，錐蟲藍法分析ECs死亡情況也得到相似的結果。Gen處理的HUVECs死 亡 率 從 （4.42±0.98）% 提 高 到（11.35±1.52）%，而 VEGF處理的 HUVECs死亡率未見提高（圖1C）。

2.2 Gen抑制VEGF處理的內皮細胞的PTK活性

已有研究報道，Gen對PTK活性有較強的抑制作用［4，7］。為檢測Gen對ECs中PTK活性是否有抑制作用，實驗將5μg／L VEGF單獨使用或將其與Gen（1、10、100μmol／L）聯合使用處理HUVECs 24h后，用PTK活性分析試劑檢測PTK活性。結果顯示，與對照組相比，單用VEGF能使PTK基礎活性提高1.3倍，1μmol／L Gen處理的ECs中，PTK活性分別較對照組下降0.82倍，較VEGF處理組下降0.65倍。添加Gen（1～100μmol／L）以劑量依賴方式降低HUVECs中PTK活性，提示Gen可抑制內皮細胞的PTK活性。

3 討論

本研究的主要結果顯示，Gen作為強效的PTK抑制劑［7］，抑制VEGF誘導的內皮細胞活化，這可能是Gen抗血管生成作用的可能機制之一。異黃酮作為大豆中的非營養素成分，廣泛存在于人類膳食中，如大豆及各種水果蔬菜，因此我們通過植物性膳食即可攝入大量的異黃酮［8，9］。流行病學調查顯示，大豆異黃酮在降低亞洲人乳腺癌和前列腺癌的發生率中發揮重要作用［4，10］。Gen（4，5，7三羥異黃酮）為大豆產品中主要的異黃酮，在動物模型中能夠抑制癌癥發生［11］。新近文獻報道，Gen對人類癌癥細胞生長的抑制作用是通過調節與細胞周期和凋亡有關的基因來實現的［12－14］。

體內和體外試驗研究表明，Gen是一種有潛力的用于癌癥化學預防的物質，因其具有抗輻射和抗腫瘤耐藥性而可用于癌癥的輔助治療［4］。前期的研究發現，Gen作為強效的PTK活性抑制劑，可以在轉錄和翻譯水平下調促血管生成因子VEGF、MMPs，uPA 的表達［5］，提示 Gen可能還有許多尚未被發現的病理生理功能。大量研究證實，實體瘤中的腫瘤血管生成是一個復雜、有序的過程，包括促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡［15－17］。而VEGF在實體瘤的生長、浸潤和轉移過程中發揮重要作用，盡管這一相互作用在一些特定腫瘤細胞類型的不同生長階段表現出顯著的差異性［18］。然而有關VEGF對ECs，尤其是對HUVECs中的信號通路的影響少有報道。正常成人的血管ECs是高度分化、相對靜止的。其活化和增殖是血管生成的起始階段。本研究明確顯示，HUVECs經VEGF處理后，內皮細胞PTK活性提高，進而可能引起下游增殖信號分子的活化及磷酸化并促進內皮細胞增殖。Gen處理以劑量依賴方式降低VEGF誘導的HUVECs PTK活性，升高凋亡率及蛋白激酶－3活性。本研究結果提示，Gen可抑制內皮細胞中的PTK活性，該結果與 Yoon等［19］發現 Gen作為PTK活性抑制劑抑制增殖活性及引起凋亡的假說一致。綜合顯示Gen具有抗血管生成作用，為其用于腫瘤轉移及其他血管增生性疾病的治療提供了新的思路。

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