絲裂原活化蛋白激酶在染料木黃酮抑制血管內皮細胞中的作用

余小平，程道梅，彭曉莉，賈皓，韓彬，2

（1.成都醫學院公共衛生系，四川 成都 610083；2.遵義醫學院公共衛生學院，貴州 遵義 563003）

血管內皮細胞（ECs）的活化、腫瘤細胞及ECs中促血管生成因子分泌的增加均可促進腫瘤的血管生成［1－3］。血管內皮生長因子（VEGF）是促腫瘤血管生成中最強的生長因子，通常由好氧細胞產生。VEGF與ECs表面的VEGF受體結合，不僅可通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路提高原ECs的活性［4］，還增加基質金屬蛋白酶（MMPs）的分泌［5］。1987年，Akiyama等［6］首次證實染料木黃酮（genistein，Gen）是一種強效的蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）抑制劑。前期的研究證實，Gen可通過抑制HER－2／neu受體磷酸化和PTK活性而下調促血管生成因子的表達［7］，ECs參與了實體腫瘤的血管生成［8］。本研究旨在探討MAPK信號通路在Gen抑制ECs活性中的作用，揭示Gen抗血管生成的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Gen標準品和VEGF購自美國Sigma－Aldrich公司。［γ－32P］ATP購自北京Yahui生物醫學工程公司。氨基端激酶（JNK）抑制劑（SP600125）、p38抑制劑（SB203580）和 ERK1／2抑制劑（PD98059）購自美國Promega公司。基質金屬蛋白酶抑制因子（MMP）－2／－9、TIMP－2／－9 酶 鏈 免 疫 吸 附 測 定（ELISA）試劑盒、Caspase－3活性分析試劑盒購自武漢Boster生物科學有限公司。抗phospho－JNK、抗phospho－p38、抗 phospho－ERK1／2、抗 phospho－MMP－2、抗phospho－MMP－9、通用型二抗以及增強化學發光系統（ECL）購自北京Santa Cruz生物技術公司。Ⅱ型和Ⅳ型膠原酶分析試劑盒購自日本Yagai公司。

1.2 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）培養和處理

采用胰酶消化法分離健康非異常妊娠母親經陰道所產健康胎兒的新鮮臍帶HUVECs，然后在含有20%特級胎牛血清、100U／ml盤尼西林、100μg／ml鏈霉素和75μg／ml內皮細胞生長添加劑（ECGS）的RPMI1640培養液，37℃，5%CO2條件下培養。經形態學及免疫細胞化學法（F－3520抗體）鑒定后將第3～6代HUVECs接種于24孔培養板，分別用5 μg／ml VEGF或1、10、100μmol／L Gen處理24h。對照組用等量的二甲基亞楓（DMSO）替代VEGF和（或）Gen處理，DMSO的終濃度≤0.1%（v／v）。

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）酶譜檢測和反相酶譜檢測

酶譜檢測中，將HUVECs培養液的上清冷凍液濃縮后在10%SDS－PAGE（含有1mg／ml凝膠）電泳。反相酶譜檢測中，將濃縮上清液在12%SDS－PAGE（0.5mg／ml凝膠＋10%的幼倉鼠腎細胞）4℃電泳，然后將凝膠用2.5%TritonX－100沖洗2次，每次15min以除去SDS。沖洗后的凝膠在酶譜緩沖液（50mmol／L Tris，pH 7.4，10mmol／L CaCl2，0.05%Brij 35）中37℃孵育過夜，考馬斯亮藍染色，最后用圖像分析軟件（Bio－Rad）對酶譜進行定量分析。

1.4 蛋白免疫印跡檢測

條件培養基離心超濾、冷凍濃縮10倍，然后進行SDS－PAGE電泳并轉印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）上。為阻斷非特異性結合，5% 脫 脂 奶 粉／Tris－緩 沖 液／0.2% 吐 溫 20 稀 釋MMP－2／－9抗體（1∶200）、MAPK抗體（抗－JNK／p38和抗－phospho－JNK／p38（1∶200）。采用 ECL 檢測蛋白表達情況。

1.5 MMPs表達分析

收集培養液上清，使用ELISA試劑盒按照說明書分析 MMPs（MMP－2／－9）及其抑制劑（TIMP－2／－9）的表達情況，450nm下測吸光度［A，舊稱光密度（OD）］值，每個樣品測3次。

1.6 溶膠原和明膠分解活性分析

取新鮮分離的培養液上清，按II型和IV型膠原蛋白酶分析試劑盒操作指南進行，檢測熒光標記底物的清除情況，分析溶膠原和明膠分解活性。

1.7 統計分析方法

2 結果

2.1 Gen阻斷VEGF誘導HUVECs的MMPs分泌和活性

與對照相比較，VEGF處理后MMP－2和MMP－9水平顯著提高。Gen以劑量依賴方式（1～100μmol／L）降低 MMP－2（圖1A）和 MMP－9（圖1B）水平。電泳分析結果顯示，VEGF處理24h顯著增加MMP－2和MMP－9溶膠原活性，而Gen以劑量依賴性方式降低MMP－2和MMP－9溶膠原活性（圖1C）。結果提示，Gen處理HUVECs將減少VEGF誘導的MMP－2／－9的分泌，并降低其酶解活性。

為進一步確定實驗中觀察到的Gen對HUVECs的抑制作用不是由于Gen直接與培養基中的蛋白酶相互作用引起的，將1、10或100μmol／Gen孵育HUVECs 24h后除去培養基，將培養的細胞繼續在5μg／L VEGF中孵育4h。二次孵育終點時收集培養基，并用熒光標記底物進行分析。結果 發 現，Gen 對 MMP－2（圖 1E）and MMP－9（圖1F）活性仍表現出抑制效應，因而溶膠原和凝膠分解活性的下降是由于HUVECs釋放的MMP－2／－9蛋白數量的減少（圖1G）。

此外，還發現VEGF對TIMP－2／－9的分泌和活性均沒有影響，且Gen對TIMP－2／－9的含量及活性均也沒有顯著的影響（數據未顯示），由此認為Gen對MMPs活性的抑制作用不是由于增加MMPs抑制劑TIMPs活性而導致的。

2.2 Gen抑制VEGF誘導的內皮細胞中JNK和p38活化

已有研究顯示，VEGF介導的信號可通過MAPK磷酸化引起增殖反應［9，10］。為確證 MAPK是否參與了VEGF誘導的增殖過程，分別利用JNK抑制劑 SP600125、p38抑制劑SB203580、ERK1／2抑制劑PD98059證實MAPK信號分子在VEGF信號通路中的可能作用。細胞凋亡率（圖2A）及凋亡蛋白酶capase－3活性（圖2B）結果顯示，SP600125（10μmol／L）和SB203580（10μmol／L）特異性地阻斷了VEGF誘導的內皮細胞活化。VEGF誘導的MMP－2／－9的分泌也減少（圖2D）。而PD98059（10 μmol／L）不能降低 VEGF誘導的 MMP－2／－9的分泌，同時對細胞凋亡和死亡也沒有明顯影響。上述結果提示p38和JNK活化可能參與VEGF誘導MMPs生成。

用抗磷酸化JNK（圖3A）和抗磷酸化p38（圖3B）抗體檢測發現，HUVECs經Gen處理后，劑量依賴性地減弱了VEGF介導的JNK和p38活化，Gen對VEGF誘導的ERK1／2活化作用沒有明顯影響，提示Gen可抑制內皮細胞中VEGF誘導的JNK和p38的活化。

3 討論

前期研究發現，Gen是一種強效的PTK活性抑制劑，可在轉錄和翻譯水平下調促血管生成因子VEGF、MMPs、uPA 的表達［7］。本研究結果顯示，作為強效的PTK抑制劑Gen，可通過抑制JNK和p38活化及MMPs的分泌和活性從而抑制VEGF誘導的內皮細胞活化，這可能是Gen抗血管生成作用的機制之一。Gen（4，5，7三羥異黃酮）為大豆產品中主要的異黃酮，在動物模型中能夠抑制癌癥發生［11，12］。體內和體外實驗研究也顯示，Gen具有抗輻射和抗藥性，可用于癌癥的輔助治療［13］。

目前有關VEGF對內皮細胞，尤其對HUVECs中的信號通路的影響少有報道。正常成人的ECs是高度分化、相對靜止的。ECs的活化和增殖是血管生成的起始階段。本研究結果顯示，VEGF刺激后不僅增加了MMP－2／－9的分泌，而且使其溶膠原和明膠分解活力增大。MMPs能降解血管生成中腫瘤細胞外基質成分，該類酶通常都是以原酶的形式出現，在發揮降解基質時需要活化［14－16］。Gen處理減少內皮細胞中 MMP－2／－9的分泌，并使其活性降低，提示Gen具有抗血管生成作用，這與課題組前期的研究結果一致［7］。但對TIMPs的分泌及活性不影響，表明Gen對MMPs活性的抑制作用不是通過TIMPs實現的。

我們發現Gen以劑量依賴性抑制VEGF誘導的JNK和p38的磷酸化。該結果與已往文獻報道一致，即Gen可有效抑制位于腫癌組織或其他組織中的內皮細胞 MAPK活性［17，18］，但 Gen未能顯著降低內皮細胞ERK－1／2的磷酸化水平，這與Sawai等［19］報道Gen能抑制二萜醇酯類誘導的ERK－1／2磷酸化的研究結果不一致。這種差異或許是因于實驗條件的不同而導致的。

Gen在體內無法達到實驗中使用的濃度100 μmol／L［6，13］。單獨攝入大豆膳食時，人血漿中 Gen的最大濃度可達1～4μmol／L［20］。本研究中，將HUVECs暴露于10μmol／L和更高濃度的Gen后導致MMP－2／9生成減少。在本實驗中使用的濃度范圍內，Gen同時可作為非選擇性酪氨酸激酶抑制劑和內皮生長因子受體激酶抑制劑［7，21］。高濃度Gen處理后使 MMP－2／9生成減少，可歸因于抑制PTK活性。盡管未對該假設進行論證，事實上在Gen抑制酪氨酸激酶濃度范圍內，Gen已被用于探討對MMPs生成的抑制作用研究［22］。同時更高濃度Gen（20～370μmol／L）已被用于研究其對腦內皮細胞中環前列腺素生成的影響［23］。

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