利用siRNA敲除P-選擇素受體CD24對黑色素瘤細胞增殖的影響

李明 李巖 陳偉強 余雪松

CD24是一種低分子量高度糖基化的蛋白質粘附分子，作為P-選擇素的配體之一，CD24參與介導單核細胞、中性粒細胞與內皮細胞、血小板之間的粘附。近年來，臨床研究發現CD24高表達于多種腫瘤細胞表面，并且與腫瘤的預后密切相關［1］。對于其作用機制，以往研究較多的集中的CD24與腫瘤轉移的關系上，而CD24在腫瘤增殖中的作用研究尚不十分明確。因此，本實驗用siRNA干擾CD24的表達，觀察抑制CD24表達對細胞的增殖的影響，初步探討CD24在腫瘤生長中的作用。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 引物、分子量Marker和質粒提取試劑盒(大連 TaKaRa公司);兩步法 RT-PCR試劑盒、Trizol、Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司);抗CD24抗體和抗βactin抗體(美國Santa Cruze公司);ECL化學發光試劑盒(美國Pierce公司);蛋白電泳儀、電轉儀、雜交箱和酶標儀(美國Bio-Rad公司)。人黑色素瘤細胞株B16F10為本室保存。靶向CD24的siRNA干擾質粒pSi-CD24由本室構建，按試劑盒說明書提取備用［2］。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 取對數生長期的人黑色素瘤細胞B16F10細胞，接種于6孔細胞培養板內，待細胞達到80%融合時，按照說明書用脂質體Lipofectamine 2000轉染細胞。實驗分為對照組和pSi-CD24組。

1.2.2 B16F10細胞中CD24 mRNA表達的變化 轉染24 h后，用Trizol法提取細胞總RNA，按照說明書以Oligo-d(T)18為引物逆轉錄合成第一鏈cDNA，用特異性引物擴增CD24和β-Actin。引物序列和擴增方法見本課題組前期發表的論文［2］。PCR產物用1.5%瓊脂糖電泳，拍照，觀察。

1.2.3 B16F10細胞中CD24蛋白表達的變化 轉染48 h后按照試劑盒操作步驟提取細胞總蛋白，取20 μg樣品煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加抗 CD24(1∶1000)或抗 β-Actin(1∶1000)單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標記的相應二抗稀釋液(1∶3000)37℃孵育1 h，ECL法顯影，常規洗片拍照。

1.2.4 pSi-CD24對B16F10細胞增殖的影響 取空白對照組和pSi-CD24組細胞細胞，接種至96孔板上，各組設4孔，在轉染后 0、24、48 和 72 h 后加入 MIT(5 mg/m1)20 μl，用MTT法檢測細胞增殖情況，并繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 pSi-CD24對CD24 mRNA和蛋白表達的影響 RT-PCR和Western blot結果顯示，在正常情況下，黑色素瘤細胞B16F10高表達CD24，而轉染重組質粒pSi-CD24后，B16F10細胞中CD24 mRNA和蛋白水平的表達均明顯降低，說明重組質粒pSi-CD24能抑制CD24的表達。結果見圖1。

圖1 重組質粒pSi-CD24對B16F10細胞CD24表達的影響

2.2 pSi-CD24對B16F10細胞增殖的影響 MTT結果顯示，轉染pSi-CD24質粒后，黑色素瘤細胞B16F10的增值明顯被抑制，在48 h和72 h與對照組差異有統計學意義。結果見圖2。

圖2 重組質粒pSi-CD24對B16F10細胞增殖的影響

3 討論

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種簡單有效的基因沉默工具，主要通過誘導序列特異性的mRNA降解，從而產生相應的功能表型缺失，現已被廣泛應用于基因治療和功能基因組學的研究中［3］。在哺乳動物細胞的RNAi研究中，通過質粒等表達載體在細胞內直接轉錄形成siRNA具有經濟和容易操作、作用持續時間長等優點，是目前siRNA最常用的方法。我們前期采用具有RNA聚合酶Ⅲ啟動子的pSilencer 3.1載體，成功構建了靶向CD24基因的表達載體pSi-CD24［2］。本實驗用 RT-PCR和 Western blot在黑色素瘤細胞B16F10中發現，轉染pSi-CD24質粒后細胞CD24在mRNA水平和蛋白水平的表達較對照組均有明顯降低，說明pSi-CD24可以在細胞內持續表達siRNA，高效特異地抑制CD24的表達，為進一步研究CD24基因的功能和以CD24為靶點進行腫瘤治療奠定了基礎。

作為P-選擇素的配體，CD24高表達能增強腫瘤的侵襲能力和轉移能力［4］。研究發現，在病理情況下CD24和P-選擇素介導了腫瘤細胞與血小板及內皮細胞的粘附與結合，腫瘤細胞與血小板結合后，形成血小板血栓，可以保護腫瘤細胞逃避免疫監視，降低免疫細胞對腫瘤的殺傷效應;腫瘤細胞和內皮細胞的粘附則有助于腫瘤細胞從循環系統轉移到組織中形成轉移灶，因此，CD24/P-選擇素的結合被認為與腫瘤轉移密切相關。還有研究證實CD24也介導了腫瘤細胞與纖維粘連蛋白等細胞外基質的粘附作用，敲除CD24可以降低SW620細胞的粘附能力［5］。CD24對腫瘤的生長也具有調控作用，Smith等發現敲除CD24基因導致腫瘤細胞凋亡增加［6］。有學者認為這與CD24能促進腫瘤微血管形成有關，也有研究認為與CD24促腫瘤細胞生長有關。本實驗利用siRNA技術敲除黑色素瘤B16F10細胞CD24基因表達，發現抑制CD24表達可以降低細胞的增值能力，說明CD24可能通過某些信號途徑促進腫瘤細胞增殖，進一步證實了上述結果。

綜上所述，CD24在多種腫瘤中高表達，與腫瘤的生長、粘附和轉移密切相關，抑制CD24表達可以降低腫瘤細胞的增殖能力、誘導腫瘤細胞凋亡、阻礙腫瘤的轉移，因此CD24可能是一個治療腫瘤的新靶點，但對其作用機制尚需進一步的深入研究。

［1］鄒萌萌，吳誠義.CD24與乳腺癌及其干細胞的研究進展.中國普通外科雜志，2008，17(5):480-483.

［2］李明，龔水明，李巖，等.靶向CD24的siRNA表達載體構建及其沉默效應的研究.解剖學研究，2010，32(3):174-177.

［3］Mello CC，Conte D Jr.Revealing the world of RNA interference.Nature，2004，431(7006):338-342.

［4］Friederichs J，Zeller Y，Hafezi-Moghadam A，et al.The CD24/P-selectin binding pathway initiates lung arrest of human A125 adenocarcinoma cells.Cancer Res，2000，60(23):6714-6722.

［5］鄧啟亮，王新穎，王偉飛，等.抑制CD24表達對SW620細胞粘附能力影響的研究.數理醫藥學雜志，2010，23(2):156-159.

［6］Smith SC，Oxford G，Wu Z，et al.The metastasis-associated gene CD24 is regulated by Ral GTPase and is a mediator of cell proliferation and survival in human cancer.Cancer Res，2006，66(4):1917-1922.