高效液相色譜法測(cè)定牛黃化毒片中連翹苷含量*

孟凡英，張麗芳，侯 婷，王 佳，盧 瓏

牛黃化毒片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二十冊(cè)》，執(zhí)行藥品標(biāo)準(zhǔn)為WS3-B-3567-98。是由制天南星、連翹、金銀花、白芷、甘草、乳香、沒(méi)藥、人工牛黃8味藥材組成。有解毒消腫，散結(jié)止痛的功效，可以用于瘡瘍、乳癰、紅腫疼痛的病痛的治療。現(xiàn)執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了性狀及綠原酸的薄層色譜鑒別和檢查項(xiàng)。為有效地控制藥品質(zhì)量，本文增加了連翹中連翹苷的含量測(cè)定方法。修訂后的標(biāo)準(zhǔn)可用于牛黃化毒片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、DAD檢測(cè)器、Chem Stations色譜工作站）。1.2 試藥 連翹苷對(duì)照品（批號(hào)為110826-200712，供含量測(cè)定用，含量以99.9%計(jì)）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。乙腈為色譜純，水為去離子水。牛黃化毒片樣品由（天津市同仁堂股份有限公司提供批號(hào)為 584004、783001、788002、885001）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Dikma C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水（23∶77）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；流速1.0 mL/min；柱溫室溫。進(jìn)樣量10 μL，靈敏度0.02AUFS。分別取樣品測(cè)定項(xiàng)下溶液10 μL，各重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，量出連翹苷的保留時(shí)間和半峰高寬，計(jì)算理論塔板數(shù)，結(jié)果其理論塔板數(shù)均大于2 000。連翹苷保留時(shí)間為25 min，拖尾因子亦符合藥典規(guī)定。連翹苷的液相色譜圖見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照?qǐng)D譜顯示陰性的色譜峰。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取連翹苷對(duì)照品5 mg，置250 mL棕色量瓶中用50%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，制成1 mL中約含20 μg對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液的制備 取本品20片，除去包衣，研細(xì)，精密稱取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，精密移取2 mL，上中性氧化鋁柱（100~120目，1 g,內(nèi)徑 1 cm），用 50 mL 70%乙醇洗脫，蒸至約15 mL，置25 mL容量瓶中用70%乙醇定容。0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。同法，取不含連翹的樣品制備成陰性對(duì)照品溶液。

2.4 線性考察 精密吸取連翹苷對(duì)照品溶液（468.5 g/L）1、2、3、6、9、12、15 mL，分別置 25 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，分別配置成0.194 6、0.389 2、0.583 8、1.167 6、1.751 4、2.335 2、2.919 0 g/mL的溶液，按“2.1色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)樣10 μL。進(jìn)樣后，記錄峰面積，以濃度X與峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=204298.1315X－3055.7124（r=0.9999）。結(jié)果表明連翹苷在0.194 6～2.919 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為889002的樣品1份，按“2.3供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，按“2.1色譜條件”分析，精密吸取供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定樣品中連翹苷峰面積值，平均峰面積值為 78.634 522的峰面積（RSD）=0.22%（n＝6）。結(jié)果表明，精密度符合要求。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為889002的樣品1份，按“2.3供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，按“2.1色譜條件”分析，分別精密吸取供試品溶液10 μL，分別于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣，測(cè)定連翹苷的含量RSD=0.87%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為889002的樣品6份，按“2.3供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，按“2.1色譜條件”分析，測(cè)定連翹苷的含量，結(jié)果測(cè)得樣品平均含量為0.082 34 mg/片，RSD=0.67%，結(jié)果表明，重現(xiàn)性符合要求。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為889002的樣品6份，各1.0 g，精密稱定，精密加入每1 mL含連翹苷對(duì)照品0.018 29 mg的甲醇溶液15 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，精密移取2 mL上中性氧化鋁柱（100~120目，1 g，內(nèi)徑 1 cm），用 50 mL 70%乙醇洗脫，蒸至約15 mL，置25 mL容量瓶中用70%乙醇定容。0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得，作為供回收率測(cè)定用的供試品溶液，按“2.1色譜條件”分析，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為101.13%，RSD=0.76%。

2.9 樣品含量測(cè)定 取不同批次的樣品，按“2.3供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，按“2.1中色譜條件”測(cè)得各自連翹苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 牛黃化毒片連翹苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

通過(guò)對(duì)對(duì)照品溶液在波長(zhǎng)200～400 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描顯示，連翹苷在230 nm處有最大吸收。流動(dòng)相的選擇參考相關(guān)文獻(xiàn)[1]，采用不含有緩沖鹽的流動(dòng)相，以保證色譜柱的使用質(zhì)量，故最終將流動(dòng)相定為乙腈-水（23∶77）。取同一批號(hào)（889002）2份，精密稱定，色譜柱分別為phenomenex Luna C18250mm×4.6mm，5μm，Agilent ZORBAX SB-C184.6mm×250mm，5μm，Dikma DiamonsilC18（2）250mm×4.6mm，5 μm，結(jié)果平均總量為 0.082 07 mg/片，RSD=1.75%。使用不同色譜柱對(duì)含量測(cè)定無(wú)影響。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：109-111.