高效液相色譜法測定馬兜鈴酸A在細胞培養(yǎng)基中含量變化*

王 麗，周慧芳，張艷軍，邊育紅

馬兜鈴酸為硝基菲類有機酸，主要存在于馬兜鈴科馬兜鈴酸屬、細辛屬、木通科木通屬等[1]。馬兜鈴酸藥理作用廣泛,有抗感染、抗癌及增強細胞免疫等功能[2-3]。長期以來，含有馬兜鈴酸的中藥材被廣泛應用于治療各種疾病。近些年，隨著臨床報道和實驗研究，馬兜鈴酸的毒性、致癌性和其他毒性作用相繼被發(fā)現(xiàn)[4]。目前有關馬兜鈴酸毒性的機制尚不十分清楚[5]，國內(nèi)外學者通過大量體外實驗證明其毒性作用可能的機制。因此，研究馬兜鈴酸的體外檢測方法，了解其在細胞培養(yǎng)基中含量變化的特點，將有助于深入研究其毒理機制，從而為其毒副作用的防治提供理論依據(jù)。本實驗采用高效液相色譜（HPLC）法，準確測定了藥物在培養(yǎng)基中不同時間的含量變化情況，為準確考察藥物對于細胞的毒性作用奠定了基礎。

1 實驗材料

1.1 試劑 馬兜鈴酸A對照品（天津一方科技有限公司，批號：200406）；甲醇（色譜純，天津市光復精細化工研究所）；色譜分析用水（娃哈哈飲用純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司），其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀 (日本島津);LC-solution色譜工作站 (日本島津);SPD-20A紫外檢測器（日本島津）；KQ－100A型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；XS204分析天平（METTLER TOLEDO）。

2 方法學考察

2.1 色譜條件 C18色譜柱(150 nm×4.6 nm，5 μm)；流動相：甲醇-水（含 3%的冰醋酸）（70∶30，V/V）；檢測波長260 nm，柱溫30℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL。

2.2 對照品儲備溶液的配制 精密稱取馬兜鈴酸A對照品10 mg，以甲醇溶解于100 mL容量瓶中,定容至刻度，即得濃度為0.1 g/L的馬兜鈴酸A對照品母液。

2.3 培養(yǎng)基樣品預處理 將細胞培養(yǎng)基精密取出，加入3倍量甲醇，用渦旋儀渦旋30 s，再用10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液進樣。

2.4 標準曲線的制備 取馬兜鈴酸A對照品儲備溶液，配制成馬兜鈴酸 A 50，25，10，5，2.5，0.5 mg/L的系列溶液，分別進行測定。以峰面積（Y）對濃度（X）作線性回歸，得線性范圍和回歸方程，見表1，圖 1。

表1 培養(yǎng)基樣品中的線性關系

圖1 馬兜鈴酸A標準曲線

2.5 精密度實驗 配制馬兜鈴酸A同一濃度的對照品溶液，進行測定。每隔1 h測定1次，測6次，計算日內(nèi)精密度；每隔1 d測定1次，測6 d，計算日間精密度。

實驗結(jié)果表明，馬兜鈴酸A培養(yǎng)基中的日內(nèi)、日間精密度相對標準偏差（RSD）分別為0.96%、1.92%，均符合要求。

2.6 回收率實驗 配制馬兜鈴酸A低、中、高3個濃度的對照品溶液，加入200 μL空白培養(yǎng)基，按“培養(yǎng)基樣品預處理方法”處理樣品，分別進行測定。按照對照品測得量和加入量之比計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)基樣品中的回收率(s，n=3)

表2 培養(yǎng)基樣品中的回收率(s，n=3)

加入量（μg）測得量（μg）平均回收率（%）RSD（%）2.5 2.35±0.02 94.01 0.91 10 10.43±0.24 104.34 2.26 50 51.39±0.77 102.78 1.50

實驗結(jié)果表明，馬兜鈴酸A的低、中、高3種濃度在培養(yǎng)基中的回收率符合要求。

2.7 穩(wěn)定性實驗 取馬兜鈴酸A對照品儲備溶液，配制成培養(yǎng)基樣品中含馬兜鈴酸A 15 mg/L的溶液，按“培養(yǎng)基樣品預處理方法”處理樣品，將所配藥液于冰箱中冷藏，分別在 0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h進行測定。以對照品測得量計算相對標準偏差。

實驗結(jié)果表明，馬兜鈴酸A樣品在72 h內(nèi)RSD為1.96%，樣品在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 專屬性實驗 在2.1項下的色譜條件下，測定馬兜鈴酸A對照品、空白培養(yǎng)基及加藥后培養(yǎng)基，色譜圖，見圖2-3。

圖2 空白培養(yǎng)基色譜圖

圖3 加藥后培養(yǎng)基色譜圖

由圖可知馬兜鈴酸A的保留時間約為4.7 min,空白培養(yǎng)基中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中濃度的分析。

2.9 培養(yǎng)基中不同時間點樣品含量變化測定 將馬兜鈴酸A加入含有培養(yǎng)基的6孔板，于37℃,5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別以不同時間點從含藥6孔板中取出培養(yǎng)基[6]，按“培養(yǎng)基樣品預處理方法”處理樣品，進行測定。以峰面積計算馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中不同時間的藥物濃度。數(shù)據(jù)見表3，其藥物濃度—時間曲線見圖4。實驗結(jié)果表明馬兜鈴酸A在本實驗所用培養(yǎng)條件下72 h內(nèi)含量基本穩(wěn)定。

表3 馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中的濃度數(shù)據(jù)(s，n=3)

表3 馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中的濃度數(shù)據(jù)(s，n=3)

時間（h）馬兜鈴酸A濃度（mg/L）0 14.06±0.46 13.91±0.50 2 13.79±0.38 6 13.73±0.36 12 13.72±0.35 24 13.68±0.33 36 13.67±0.21 48 13.64±0.33 72 13.59±0.22 1

圖4 馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中的藥-時曲線

3 討論

在考察培養(yǎng)基樣品預處理方法時，比較了不同方法沉淀蛋白（甲醇、高氯酸）及乙醚提取法，實驗結(jié)果表明高氯酸沉淀蛋白法及乙醚提取法回收率較低，甲醇直接沉淀蛋白法，回收率較高，可以滿足檢測要求，且操作簡便快捷，故本實驗采用甲醇作為沉淀試劑。

體外藥理實驗中，通常采用向含有細胞的培養(yǎng)基中多次加入一定濃度的藥物以考察其對細胞的作用情況。因此，建立藥物在培養(yǎng)基中的測定方法，搞清其在細胞培養(yǎng)基中的變化情況，將會對體外細胞培養(yǎng)實驗具有重要的意義[7]。本實驗采用DMEM培養(yǎng)基（含10%血清），pH約為7.4，本實驗結(jié)果表明，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)條件下72 h內(nèi)馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中含量基本穩(wěn)定，這對于以后實驗中，藥物作用時間及細胞換液時間的選擇具有一定的參考意義。

本實驗建立了高效液相色譜法測定細胞培養(yǎng)基中馬兜鈴酸A含量的方法，實驗證明，本方法能夠有效地測定藥物在培養(yǎng)基中含量的變化情況，靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡便快捷，對準確考察馬兜鈴酸A對細胞的作用情況有指導意義。

[1]蔣貴仲，陳 靈.中藥中馬兜鈴酸A的毒性研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2008，24（9）：84－87.

[2]陳孟蘭，朱正蘭.馬兜鈴屬植物的藥理作用研究進展[J].武漢生物工程學院學報，2007，3（1）：59－62.

[3]張萬明,馬淑蘭.馬兜鈴酸A及含有馬兜鈴酸A中藥的研究概述[J].河北北方學院學報，2007，23（6）：35－38.

[4]張曉妍.馬兜鈴酸腎病實驗研究近況[J].遼寧中醫(yī)學院學報，2005，7（1）：76－77.

[5]許勇芝，陳麗萍，劉華鋒，等.馬兜鈴酸致腎小管上皮細胞損傷中p53和Caspase-3活性的變化[J].第四軍醫(yī)大學學報，2009，30（5）：398－401.

[6]沈岳飛，羅杰峰，莫雪安，等.小鼠胚胎干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].廣西醫(yī)科大學學報，2006，23（1）：43－45.

[7]李 越，杜 嶸，張艷軍.高效液相色譜法測定人參皂苷Rg1與黃芩苷在細胞培養(yǎng)基中的含量變化[J].天津中醫(yī)藥，2006，23（2）：160－162.