高效液相色譜法同時測定金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量*

張元元，李 進，陳 濤，李鳳麗

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花[1]。又名銀花、金花、忍冬花、金藤花等。其味甘,性寒,具有清熱解毒、疏散風熱之功效,臨床常用于治療肺炎、急性痢疾、嬰幼兒腹瀉、宮頸糜爛、眼科炎癥等。金銀花中含揮發油、黃酮類、三萜類、有機酸、苷類、微量元素等成分，其主要活性成分是綠原酸以及以木犀草苷為代表的黃酮類成分[2]。目前常規的檢測方法是分別采用高效液相色譜（HPLC）法測定綠原酸和木犀草苷的含量，增加了檢測工作量,且色譜峰不易分開，峰形、分離度也不理想。本實驗建立了HPLC法同時檢測金銀花中兩種成分的含量，在此色譜條件下兩種成分分離完全，該方法簡便，準確，快速易行，可為金銀花的質量控制提供一定的參考[3]。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 儀器：美國Waters高效液相色譜儀，Waters600E泵，2998二級管陣列檢測器（DAD），Waters Empower工作站；超聲波清洗器TCQ250（北京醫療設備二廠）；電子分析天平JA2003（上海精科天平廠）等。

1.2 試藥 綠原酸對照品（110753-200413），木犀草苷對照品（111720-200905），由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純；水為重蒸水,自制；其他試劑均為分析純。

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾及初開的花，山東平邑縣產（10060）。

2 條件與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Xterra@PR185（46nm×250nm，5 μm）；Waters In-Line 脫氣機；流動相：乙腈-0.5%冰乙酸，二元梯度洗脫，0～15 min，乙腈10%～20%，15～30 min，乙腈 20%～25%，30～40 min，乙腈 25%～35%,40～45 min，乙腈 35%～10%；流速 1.0 mL/min；檢測波長 350 nm；柱溫：室溫；進樣量：10 μL；理論塔板數按綠原酸計算應不低于1 000，理論塔板數按木犀草苷計算應不低于20 000。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱定對照品綠原酸、木犀草苷適量，加70%甲醇制成1 mL含綠原酸36.4μg，含木犀草苷44.4μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取金銀花細粉（過4號篩）約2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）1 h，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續濾液10 mL，回收溶劑至干，殘渣用70%乙醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

按以上色譜條件得到對照品、金銀花色譜圖。見圖 1、圖 2。

圖1 對照品色譜圖

圖2 金銀花樣品色譜圖

2.4 線性關系考察 精密稱取綠原酸、木犀草苷對照品，加70%甲醇制成1mL含綠原酸3.52mg和1 mL含木犀草苷0.19mg的溶液，作為儲備液,再分別精密量取 5、10、15、20 mL，置 25 mL 量瓶中，加 70%甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述4種濃度的對照品溶液與儲備液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件分析，測定各自峰面積（RSD），以對照品濃度（μg/μL）為橫坐標，峰面積值為縱坐標，求得回歸方程：綠原酸：Y=41 019.10X+45 849.75，r=0.999 9；木犀草苷：Y=2 537.98X+269.08，r=0.999 5。結果表明線性良好。

2.5 精密度實驗 精密吸取上述混合對照品溶液，連續進樣6次，10 μL/次，測定峰面積綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD值分別為1.0%和1.1%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復性實驗 取同一批金銀花樣品（山東產）2 g按“2.3”項下方法提取，按“2.1”項下方法測定含量，連續進樣6次，測定樣品中綠原酸、木犀草苷的峰面積，測得峰面積值的RSD分別為為1.90%和2.3%，符合要求。

2.7 重現性實驗 取同一批金銀花樣品（山東產）2 g按“2.3”項下方法提取，按“2.1”項下方法測定含量。平行操作6份,計算綠原酸、木犀草苷平均含量分別為 1.840%（RSD＝2.0%）、0.095%（RSD＝2.32%）符合要求。

2.8 穩定性實驗 取“2.3供試品溶液”項下，按“2.1 色譜條件”項下于配置 0、1、2、4、6、12 h 分別進樣10 μL，進行含量測定，結果綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD為1.90%和1.41%，結果表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.9 加樣回收率實驗 精密稱取6份已重復測定的金銀花藥材粉末1 g，分別精密加入一定量的對照品，按“2.3”項下方法制備供試品液，按“2.1”項下方法測定含量，計算回收率。結果見表1-2。

表1 綠原酸的加樣回收率實驗測定結果

表2 木犀草苷的加樣回收率實驗測定結果

2.8 樣品含量測定 按“2.1”項下色譜條件,測定金銀花藥材中2種成分的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果%

3 討論

由于綠原酸與木犀草苷極性相差較大,而且樣品中兩者的含量差別很大，故等度洗脫不能將兩者分離。經過考察最終確定0.5%冰乙酸-乙腈作為流動相,再進行梯度洗脫條件的優化,所得圖譜基線平穩,綠原酸與木犀草苷均達到較好的分離。

2010版藥典規定通過測定綠原酸和木犀草苷的含量來綜合評價金銀花的質量。本實驗建立了HPLC法同時檢測金銀花中兩種成分的含量，在此色譜條件下兩種成分分離完全，該方法簡便，準確，快速易行，可為金銀花的質量控制提供一定的參考。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部[S].北京:中國醫藥科學技術出版社,2010:205.

[2]王發國，葉華谷，馬其俠，等.金銀花及其藥理作用[J].生物學通報，2004，39（5）：17－18.

[3]張麗玲，郭 偉.HPLC法測定腦血栓丸（I號）中芍藥苷的含量[J].天津中醫藥大學學報，2009，28（2）：86-87.