響應面法優(yōu)化紅樹莓色素的納濾濃縮條件

王金玲，毛鳳彪，2，王振宇

（1.東北林業(yè)大學 林學院，哈爾濱 150040；2.深圳華大基因研究院，深圳 518083）

樹莓（RubusideausL.）為薔薇科懸鉤子屬植物，灌木性果樹。樹莓果實具有很高的營養(yǎng)保健和藥用價值，除了富含氨基酸、礦質元素、有機酸和VC、VE等人體必需的營養(yǎng)素外[1]，還含有豐富的紅色素，據(jù)文獻報道，其含量為10～2199mg／100g fw 不等[2－5]。樹莓紅色素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、強化免疫系統(tǒng)功能、改善血液循環(huán)、降低血壓等作用[3－8]；樹莓是近年來備受研究者關注的漿果之一，將會成為未來的健康食品。

納濾（nanofiltration，NF）膜是20世紀80年代末期問世的新型分離膜，它的截留分子量介于反滲透膜和超濾膜之間，約為200～1000；納濾膜主要依據(jù)于篩分效應和電荷效應進行物質分離[9]。近年來，對于納濾技術應用于果汁的濃縮及活性物質的濃縮，如多糖、肽、黃酮、多酚等[10－12]領域已成功運用，但是應用于天然色素的濃縮純化，尚未見報道。

東北地區(qū)野生樹莓資源豐富，近幾年又開展了大面積的人工種植，提取并純化樹莓色素，應用于食品工業(yè)具有廣闊的發(fā)展空間。本研究旨在對紅樹莓果實中提取的色素進行納濾濃縮純化，得到納濾法最佳濃縮工藝，為紅樹莓色素在食品工業(yè)中的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅樹莓鮮果，市售；蒸餾水洗凈，濾紙吸去蒸餾水，去除雜物；使用95%乙醇為提取劑，采用提取溫度72.4℃，提取時間60min，料液比為1∶8.5，pH為2.0的條件提取。將提取液進行紗布過濾后抽濾，除去沉淀，測得樹莓提取原液花色苷質量濃度為12.22mg／mL，4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼炛兴闷渌噭┚鶠閲a(chǎn)分析純。

1.2 儀器設備

YP2001N 電子天平、PHS-25 數(shù)顯 pH 計、TU-1810紫外可見分光光度計均為上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；納濾膜分離裝置：膜截留分子量為300道爾頓，上海摩速科學器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗

選取對納濾有較大影響的因子進行單因素試驗以確定各因素的取值范圍。這些因素為：納濾溫度、壓力、色素溶液pH、進料質量濃度（以樹莓提取原液濃度為100%）。恒定進料體積和納濾時間，在其他因子固定的情況下變化待測定因子，測定納濾前后色素溶液的吸光度。單因素試驗選取的因子及水平見表1。

具體操作方法如下：初始納濾條件為納濾溫度20℃，壓力0.6MPa，色素溶液pH 為3，質量濃度100%，進料體積為550mL，納濾時間為15min，納濾方式為不加水循環(huán)式。

1.3.2 響應面設計

通過上述單因素試驗所得的結果，響應面試驗設計[13]選取單因素所研究的進料質量濃度、pH、溫度、壓力四個因素，設定三個水平，優(yōu)化最佳的納濾工藝參數(shù)，每個試驗重復3次。

1.4 濃縮度和截留率的計算

濃縮度（濃縮比）＝A2／A1

截留率（回收率）＝（A2×V2）／（A1×V1）×100%

A1為納濾前色素溶液吸光度，A2為納濾后色素溶液吸光度，V1為納濾前色素溶液體積，V2為納濾后色素溶液體積；A2、A1在相同的pH下測定，吸收光波長為514nm。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用sas 9.0分析及處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

圖1 紅樹莓色素納濾濃縮的單因素結果

單因素試驗結果表明（圖1），紅樹莓色素納濾純化單因素中，最佳納濾溫度為30℃；納濾膜工作壓力為0.6或0.7MPa時，納濾效果較好，鑒于納濾裝置的最大工作壓力為0.7MPa，選取0.6MPa為納濾壓力；最佳質量濃度為80%；最佳色素溶液pH為2.5。

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

2.2.1 部分因子試驗結果

表2 部分因子設計編碼值及水平

表3 部分因子試驗設計及結果

為了快速從多個影響因子中找到對納濾效果影響最大的因子，以單因素試驗中獲得的最佳值為基礎，將各因子的最佳值確定為中心值，并進行適當?shù)臄U充而成為自變量的取值范圍，以響應面方法優(yōu)化納濾濃縮純化紅樹莓色素的最佳條件；設計部分因子試驗，各因子編碼值見表2，試驗設計和結果見表3，分析結果見表4和表5。

對部分因子試驗結果進行回歸分析表明（表4），pH（X1）和質量濃度（X3）對納濾膜濃縮純化樹莓色素在99%和95%的水平上有顯著的影響，而溫度（X2）和壓力（X4）對納濾效果的影響不顯著，各因子間沒有交互作用。由回歸分析結果可得一次擬合線性回歸方程：

對方程進行方差分析（表 5），F(xiàn)＝5.04，P＝0.0080，說明模型在概率α＝0.01水平上足夠顯著擬合試驗數(shù)據(jù)。

對試驗數(shù)據(jù)平均值與中心點試驗數(shù)據(jù)的平均值進行t－檢驗，t－檢驗結果表明，在方差相等和方差不等的條件下，中心試驗點平均值和部分重復試驗平均值差異不顯著（P＝0.7104），說明試驗的中心點（濃縮度值最大）不在當前試驗的設計范圍之內，需應用最陡爬坡法尋找試驗的最優(yōu)空間。

表4 部分因子試驗回歸分析表

表5 部分因子試驗模型方差分析表

2.2.2 最陡爬坡試驗

FFD的檢驗數(shù)據(jù)顯示，溫度（X2）和壓力（X4）對納濾效果的影響不顯著，因此固定在零水平。pH（X1）和質量濃度（X3）對納濾膜濃縮純化樹莓色素具有顯著的影響，且X1、X3的系數(shù)為正，說明升高pH（X1）和質量濃度（X3）對納濾效果的影響效應為正。以pH（X1）和質量濃度（X3）的中心值為基準，pH以每次升高0.3為基本步長，質量濃度的基本升高步長為4，進行最陡爬坡試驗。試驗設計與結果見表6。

表6 最陡爬坡試驗

表6列出了pH和質量濃度改變的方向，即pH每次升高0.3，質量濃度每次升高4。從表中可以看出，pH3.1，質量濃度88，所對應的濃縮度（Y）達到最大為2.094，隨后濃縮度值開始下降，所以pH3.1、質量濃度88% 可用作下面優(yōu)化試驗的中心點。

2.2.3 中心組合試驗設計及響應面分析

從上述最陡爬坡試驗可以看出，響應變量Y值已接近最大響應區(qū)域。納濾膜濃縮純化樹莓色素的優(yōu)化可以利用中心組合設計對兩個獨立的過程變量進行優(yōu)化，即對pH和質量濃度進行中心組合設計。試驗設計及結果見表7和表8，數(shù)據(jù)分析見表9和表10。從表9和表10中分析結果可知，該模型在86.55%概率水平上回歸顯著，因而模型是可行的。該模型的線形項在95%的概率水平上是顯著的，平方項在99%的概率水平上非常顯著，各因素之間沒有交互作用。從對試驗數(shù)據(jù)進行多項式回歸，可以得到如下二次多項式方程：

方程中平方項的系數(shù)均為負值，方程表征的拋物面開口向下（見圖2），有極大值點。因此方程給納濾膜濃縮純化樹莓色素提供了一個較合適的模型。

表7 中心組合試驗因子及水平

表8 中心組合試驗結果

表9 中心組合試驗回歸分析結果

從分析結果還可知，質量濃度變化對納濾效果影響非常顯著，對方程 （2）求導，可以得到模型的極大值處，pH和質量濃度兩因子編碼值分別為：0.125096（X1）和0.191131（X2），實際值分別為：pH3.12和質量濃度89.53%，此時樹莓提取液中花色苷質量濃度為10.94mg／mL。此時模型預測的最大響應值即濃縮度為2.2993。為了證實模型的預測值與實測值之間的擬合程度，在上述2因子的取值處進行驗證試驗，其響應量結果為2.282±0.066（N＝3，P＝95%），預測值與試驗值之間具有良好的擬合性，表明了模型的有效性。

表10 中心組合試驗方差分析

經(jīng)響應面分析獲得的納濾膜濃縮純化樹莓色素的優(yōu)化條件如下：溫度為30℃、壓力為0.6MPa、進料花色苷質量濃度為10.94mg／L、pH 為3.12。

在最佳條件下納濾樹莓色素溶液，截留率為98.26%，色素溶液的花色苷質量濃度由10.94mg／L提高到38.24mg／L。由此可見，截留分子量為300道爾頓的納濾膜對樹莓色素的截留效果很好，具有良好的濃縮和純化作用。

pH和進料質量濃度對納濾效果影響的響應面圖如圖2所示。

圖2 pH和進料質量濃度對納濾效果影響的響應面圖

2.3 紅樹莓色素納濾濃縮動態(tài)試驗

為了研究納濾效果隨時間的變化，設計小型動態(tài)試驗，試驗結果如圖3所示。動態(tài)試驗的進料體積為1500mL，納濾時間為33min，每3min測1次截留液的吸光度，并計算濃縮度。納濾條件為：溫度30℃，壓力0.6MPa，pH3.12，進料花色苷質量濃度為10.94mg／L。

圖3 納濾濃縮動態(tài)試驗

由圖3可知，濃縮度隨納濾時間的延長逐漸增大，進料體積為1500mL時，納濾30min濃縮度為3.981，接近最大值3.996。而且通過試驗得知，由于納濾過程采用的是不加水循環(huán)方式，進料體積直接影響納濾時間的長短，從而影響納濾效果。

3 討論與結論

3.1 討論

通過本研究可見，納濾對紅樹莓色素具有很好的濃縮純化效果。紅樹莓色素屬于花色苷類物質，對溫度及pH等條件變化均比較敏感，這使得此類色素在提取后加工過程中會遇到一些穩(wěn)定性問題，而納濾工藝條件均能滿足利于花色苷色素穩(wěn)定的條件，所以納濾是花色苷類色素很好的濃縮方法。

很多學者在研究納濾方法的應用方面，采用膜通量來衡量納濾效果[14－16]，而本研究中采用濃縮度衡量紅樹莓色素納濾濃縮效果，是基于以下兩點考慮。其一，本試驗重點研究納濾能否成功運用于紅樹莓色素乃至花色苷類色素的濃縮純化，而非考察膜的工作性質；其二，隨著納濾的進行，膜通量隨納濾時間延長而下降，同時，有少量花色苷會透過納濾膜，導致膜通量不能很好的反映濃縮的效果。本研究在以濃縮度為指標考察納濾效果的同時，考察了膜對紅樹莓色素截留率，發(fā)現(xiàn)，截留率在95%～98%區(qū)間，也說明納濾膜可以很好的對紅樹莓色素進行濃縮純化。

納濾是一個動態(tài)過程，本研究中采用不加水循環(huán)式納濾，料液的體積大小直接影響到納濾的效果，料液體積大，達到相同的濃縮效果，需要的時間則長；同時隨著納濾的進行，膜開始污染，膜通量下降，納濾濃縮的效果會受到一定的影響，因此，在納濾運用到花色苷類色素濃縮純化的具體應用時，還應該考慮到料液體積及膜的清潔程度等因素的影響。

3.2 結論

紅樹莓色素納濾濃縮純化法的最佳工藝條件為，納濾溫度為30℃，壓力為0.6MPa，進料花色苷質量濃度為 10.94mg／L，pH 為 3.12。色 素 截 留 率 為98.26%。動態(tài)試驗表明，紅樹莓色素納濾濃縮度可達3.996。納濾法濃縮純化為紅樹莓色素提取后加工提供了便捷穩(wěn)定可行的方法。

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