藍靛果中花色苷含量的測定及其體外抗氧化性

劉奕琳，王振宇，2＊

（1.東北林業大學 林學院，哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業大學 食品科學與工程學院，哈爾濱150090）

花色苷是一類具有苯并吡喃結構的類黃酮化合物，具有預防心臟病、抗大腦炎癥、抗癌、延緩衰老、抗輻射、清除自由基、抗氧化等多種功效[1－3]。藍靛果是一種藍黑色的漿果，含有豐富的天然綠色無毒的色素，是天然色素的良好來源。馬自超[4]鑒定了藍靛果色素中的主要成份是花青定-3-葡萄糖，其他少量成份是花青定-3，5-雙葡萄糖、花青定-3-蕓香糖、花青定-3-龍膽二糖、芍藥定-3-葡萄糖。本實驗通過pH 示差法[5]測定藍靛果干物質中花色苷的含量，并測定其對羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藍靛果（Loniceraedulis），采摘于大興安嶺；無水乙醇；乙酸鈉；氯化鉀；鹽酸；DPPH Sigma公司、ABTS Sigma公司、無水乙醇、FeSO4、H2O2、水楊酸鈉、焦性沒食子酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵。

1.2 實驗儀器

電熱恒溫鼓風干燥箱；粉碎機；電子分析天平；旋轉蒸發儀；離心機；精密pH計；紫外分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 藍靛果花色苷的提取

將藍靛果烘干后用粉碎機粉碎，取10g藍靛果粉末，用200mL 60%乙醇溶液在常溫下浸提1h，將提取物在4000r／min離心10min后真空抽濾，濾餅再重復浸提2次，合并3次上清液，在40℃下真空旋轉蒸發濃縮，定容至250mL得花色苷提取液。取少量花色苷提取液，稀釋至一定體積，進行光譜掃描，確定其測定波長。

1.3.2 pH示差法的原理及緩沖液的配制

花色苷的顏色隨pH值的改變而發生變化，而干擾物質的特征光譜不隨pH的改變而變化。為了讓pH示差法更準確更靈敏，選擇的2個pH處測定的花色苷的吸光值差異最顯著，并且花色苷相當穩定。pH為1時，花色苷以2－苯基苯并吡喃的形式存在。pH為4.5時，花色苷以甲醇假堿的形式存在，因此選擇pH為1.0和4.5[6]

pH4.5的緩沖液的制備：準確稱取1.64g乙酸鈉用蒸餾水定容100mL，用鹽酸調pH（4.5±0.1）。

pH 1的緩沖液的制備：準確稱取1.49gKCl用蒸餾水定容至100mL。準確量取1.7mL鹽酸用蒸餾水定容至100mL，配制成0.2mol／L鹽酸溶液，將KCl溶液與鹽酸溶液以25∶67的比例混合。用KCl溶液調pH（1.0±0.1）。

1.3.3 平衡時間的確定

因為花青素在溶液介質中存在4種結構形式，這4種結構形式在某一pH下處于動態平衡，當pH改變時，動態平衡發生轉移，總的趨勢是pH降低時，平衡向紅色的2－苯基苯并吡喃陽離子移動；pH升高時平衡向藍色醌式移動。一定時間后達到一個新的平衡。因此提取液用緩沖液稀釋后，必須先靜置一段時間，等動態平衡處于穩定后，才能測定吸光值。

分別移取2份2mL花色苷提取液，分別用pH1.0和pH4.5的緩沖溶液定容至50mL，在所選擇的測定波長下測定吸光值，每隔10min測定一次吸光值，直至穩定。

血液中甘油三酯含量反映了機體對脂類的利用情況，甘油三酯含量越低意味著對機體脂肪的利用率越高。本試驗添加過瘤胃脂肪后，處理組甘油三酯含量均較對照組低（P＞0.05），說明處理組脂肪利用率較對照組高。

1.3.4 經驗公式的選擇

花色苷含量（%，w／w）＝（A／εL）×MW×DF×V／Wt×1000

式中：A－吸光度；ε－矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數，26900；DF－稀釋因子；MW－矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；V－最終體積，mL；Wt－產品重量，mg；L－光程，1cm；A＝ApH1.0－ApH4.5。

1.3.5 抗氧化指標的測定

1.3.5.1 羥自由基清除能力的測定。參照徐建國等[7]采用的水楊酸鈉絡合法略作改動，測定樣品清除羥自由基的能力。反應體系中依次加入樣品液1mL，濃度為6mmol／L FeSO4溶液2mL，濃度為6mmol／L H2O2溶液2mL，將反應體系混合均勻放置10min，再加入濃度為6mmol／L水楊酸鈉溶液2mL，靜置30min后于510nm波長下用蒸餾水調零，并測定吸光值A1；將上述體系中的水楊酸鈉溶液用相同體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測定吸光值A2；將上述體系中的樣品溶液用相同體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測定吸光值A0。羥自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

1.3.5.2 超氧自由清除能力的測定。參照郭雪峰[8]方法略作改動，測定樣品清除超氧自由基的能力。反應體系中依次加入濃度為50mmol／L Tris-HCl溶液5.7mL，樣品溶液0.2mL，濃度為6mmol／L鄰苯三酚溶液0.1mL，將混合物反應4min，滴入2滴HCl終止反應，在320nm波長下測定吸光值A1；將鄰苯三酚用等體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測定吸光值A2；將樣品溶液用等體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測定吸光值A0。超氧自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

1.3.5.3 DPPH自由基清除能力的測定。參照Blois等[9]的方法略作改動，測定樣品清除DPPH自由基的能力。配制0.2mmol／L DPPH乙醇溶液，放在棕色試劑瓶中于4℃保存，在試管中加入2mL DPPH乙醇溶液及2mL樣品溶液，混合均勻在室溫避光放置30min，于517nm波長下用無水乙醇調零，并測定吸光值A1；將DPPH乙醇溶液用等體積的無水乙醇代替，其他操作相同，測定吸光值A2；將樣品溶液用等體積無水乙醇溶液代替，其他操作相同，測定吸光值A0。DPPH自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

1.3.5.4 ABTS自由基清除能力的測定。參照 Wanwisa等[10]方法略作改動，測定樣品清除ABTS自由基的能力。用2.6mmol／mL過硫酸鉀溶液溶解ABTS甲醇溶液，配制成7.4mmol／mL ABTS儲備液，室溫避光靜置12～24h后4℃保藏?，F用時取1mL儲備液用甲醇稀釋54.7倍，在734nm吸光值為0.700±0.020，甲醇調零。在試管中加入2.850mL ABTS測定液及0.150mL樣品溶液，混合均勻在室溫避光放置2h，于734nm波長下用甲醇調零，并測定吸光值A1；將ABTS測定液用等體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測定吸光值A2；將樣品溶液用等體積甲醇溶液代替，其他操作相同，測定吸光值A0。ABTS自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

2 結果與分析

2.1 測定波長的確定

藍靛果花色苷的提取液經稀釋后，經光譜掃描如圖1所示，確定其最大吸收波長為531nm。

圖1 光譜掃描曲線

2.2 平衡時間的確定

表1 藍靛果花色苷在緩沖溶液中的吸光值與時間變化關系

2.3 藍靛果干物質中花色苷的含量

由表1中的數據，取平衡時間60min，根據經驗公式計算得花色苷的含量（%，w／w）＝（A／εL）×MW×DF×V／Wt×1000＝（1.500－0.328）×0.250×25×449.2×1000／（26900×10×1）＝12.232mg／g。

2.4 清除羥自由基的能力

羥基自由基（·OH）是化學性質最活潑的一種自由基，建立一種Fenton反應產生羥基自由基的方法，以VC作為陽性對照組，測定其清除率如圖2所示。

圖2 樣品對羥自由基的清楚能力

由圖2可以看出，花色苷對羥自由基的清除率隨質量濃度的增加而增大，并呈現明顯的量效關系，而且清除率比VC對照組高，當質量濃度為0.2mg／mL時，花色苷的清除率為90.35%，VC的清除率為58.31%，可見藍靛果花色苷對羥自由基有極強的清除能力。

2.5 清除超氧自由基的能力

超氧陰離子自由基（O2—·）是生物體中產生量最多的一種氧自由基。由鄰苯三酚的方法，以VC作為陽性對照組，測定其清除率如圖3所示。

圖3 樣品對超氧自由基的清除能力

由圖3可以看出，花色苷對超氧自由基的清除率隨質量濃度的增加而增大，并呈現明顯的量效關系，但清除率比VC對照組低，當質量濃度為0.2mg／mL時，花色苷的清除率為87.35%，VC的清除率為97.53%，可見藍靛果花色苷對超氧自由基有一定的清除能力。

2.6 清除DPPH自由基的能力

二苯基苦味肼基自由基（DPPH·）是一種穩定的以氮為中心的自由基，花色苷等抗氧化劑能與其結合使溶液顏色變淡，以VC作為陽性對照組，測定其清除率如圖4所示。

由圖1可以看出，花色苷對DPPH自由基的清除率隨質量濃度的增加而增大，并呈現明顯的量效關系，但清除率比VC對照組低，當質量濃度為0.2mg／mL時，花色苷的清除率為84.39%，VC的清除率為96.74%，可見藍靛果花色苷對DPPH自由基有較強的清除能力。

圖4 樣品對DPPH自由基的清除能力

2.7 清除ABTS自由基的能力

ABTS[2，2＇-邊氮基－雙（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]是一種供氫體。該方法作為一種用于體外測定物質總抗氧化能力的新方法，以VC作為陽性對照組，測定其清除率如圖5所示。

圖5 樣品對ABTS自由基的清除能力

由圖5可以看出，花色苷對ABTS自由基的清除率隨質量濃度的增加而增大，并呈現明顯的量效關系，而且清除率比VC對照組高，當質量濃度為10μg／mL時，花色苷的清除率為87.98%，VC的清除率為60.52%，可見藍靛果花色苷對ABTS自由基有極強的清除能力。

3 結論

藍靛果是具有花色苷的一種漿果，實驗用pH示差法測定花色苷含量，方法可靠準確，結果顯示其花色苷在干物質中的含量為12.232mg／g，可見其含量豐富。

藍靛果花色苷對四種自由基都具有較強的清除能力，對于羥自由基和ABTS自由基的清除能力較VC陽性對照組強，而對于超氧自由基和DPPH自由基的清除能力較VC陽性對照組低，實驗表明，藍靛果花色苷具有較強的抗氧化性，可以作為天然綠色的抗氧化劑，廣泛應用于食品、化妝品、藥品等領域，具有很大的發展前景。

[1]李韜，張宏宇，呂玉璋.花色苷類色素的研究進展[J].農業科技與裝備，2010（5）：23-26.

[2]倪勤學，霍艷榮，陸國權.花色苷保健功能的研究進展[J].安徽農業科學，2010，38（35）：20025-20028.

[3]Nozomu Matsunaga，Kazuhiro Tsuruma，etal.Inhibitory Actions of Bilberry Anthocyanidins on Angiogenesis[J].Phytother Res，2010，24（1）：42-47.

[4]馬自超.藍靛果中花青素色素的研究[J].中國野生植物資源，1996（2）：1-3.

[5]孫建霞，張燕，孫志健，等.花色苷的資源分布以及定性定量分析方法研究進展[J].食品科學，2009，30（5）：263-26.

[6]Lee J，Durst RW，Wrolstad RE.Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices，beverages，natural colorants，and wines by the pH differential method：collaborative study[J].J AOAC Int，2005，88（5）：1269-1278.

[7]徐建國，胡青平.決明子水提物體外清除自由基活性的研究[J].食品科學，2006，27（6）：73-7.

[8]郭雪峰，岳永德，湯鋒，等.用清除超氧陰離子自由基法評價竹葉提取物抗氧化能力[J].光譜學與光譜分析，2008，28（8）：1823-1826.

[9]Blois ms.Antioxidant determinations by the use of a stable free radical[J].Nature，2002，26：1199-1200.

[10]Wanwisa B，Soottawat B，Wonnop V，et al.Antioxidative activity of Mungoong，an extract paste，from the cephalothorax of white shrimp（Litopenaeus vannamei）[J].Food Chemistry，2008，106：185-193.