反相高效液相色譜法測定燒傷涂膜中黃芩苷含量

張秋紅，張忠義，王曙東

(1.中國人民解放軍南京軍區南京總醫院制劑科，江蘇 南京 210002;2.南方醫科大學珠江醫院藥劑科，廣東 廣州 510282)

燒傷涂膜是醫院中藥制劑，用于治療深、淺Ⅱ度燒傷[1]，處方中含黃芩和虎杖等。為控制制劑質量，筆者采用薄層色譜法鑒別黃芩[2]，用反相高效液相色譜法測定黃芩苷含量[3-4]，報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，包括Waters 1525雙泵，Waters 2996二極管陣列檢測器，Waters Millennium 32色譜工作站(美國Waters公司)。黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所);燒傷涂膜(醫院自制，含黃芩、大黃、殼聚糖等);甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃芩薄層色譜鑒別

精密稱取本品20 g，加水100 mL，用稀鹽酸調pH至2，加乙酸乙酯30 mL，水浴回流提取2 h，收集乙酸乙酯液，酸水層用乙酸乙酯萃取2次，合并提取液，揮干，殘渣加乙醇5 mL溶解，上14～30目聚酰胺柱，先用水洗脫至洗出液無色，再用80%乙醇洗脫，收集洗出液200 mL，回收乙醇，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液;精密稱取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液;取黃芩對照藥材2 g，加乙醇50 mL，水浴回流提取1 h，濾過，蒸干，殘渣加水30 mL，用稀鹽酸調pH至2，用乙酸乙酯萃取3次，每次15 mL，合并萃取液并揮干，殘渣加乙醇5 mL溶解，上14～30目聚酰胺柱，先用水洗脫至洗出液無色，再用80%乙醇洗脫，收集洗出液200 mL，回收乙醇，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為對照藥材溶液;按處方稱取除黃芩外的其余藥材，制成涂膜劑，依供試品溶液配制方法制成陰性對照品溶液。吸取上述4種溶液各10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸-水(4 ∶2 ∶1)為展開劑，展開，晾干。日光下呈綠色，紫外光燈(365 nm)下呈褐色。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上有相同斑點，陰性對照品溶液則無此斑點(圖1)。

圖1 黃芩薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Lichrospher C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇-0.2%磷酸(55∶45);流速:1.0 mL/min;檢測波長:280 nm;柱溫:室溫。

2.2.2 溶液制備

精密稱取黃芩苷對照品5.99 mg，配成質量濃度為3.00 g/L的對照品貯備液。分別取3批樣品各20 g，加水20 mL，用稀鹽酸調pH至2，加乙酸乙酯20 mL，水浴加熱回流2 h，放冷，取乙酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液;取不含黃芩的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統適用性試驗:吸取2.2.2項下3種溶液，分別注入色譜儀，記錄色譜圖。黃芩苷的保留時間約為5.9 min，陰性對照品溶液在此處無干擾峰，說明對樣品含量測定無干擾。理論塔板數以黃芩苷計不低于3 000，黃芩苷色譜峰與相鄰未知色譜峰的分離度不低于1.4。色譜見圖 2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關系考察:精密吸取對照品貯備液1.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。再精密吸取稀釋液1.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，使黃芩苷質量濃度分別為 3.000，2.250，1.688，1.266，0.949，0.712 g/L，取10 μL進樣測定峰面積。以峰面積(A)對質量濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程 A=2.93×107C+2.58×106，r=0.998 2(n=6)。結果表明，黃芩苷質量濃度在0.712～3.00 g/L范圍內與峰面積有良好的線性關系。

精密度試驗:精密稱取同一對照品溶液，重復進樣6次。結果黃芩苷峰面積積分值的 RSD為0.97%(n=6)。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，依法測定峰面積5次，每次間隔1 h。結果的 RSD=0.43%(n=5)，表明供試品溶液在4 h內穩定。

重現性試驗:取同一批號的樣品，依法制備供試品溶液并測定含量。結果的 RSD=0.93%(n=6)，表明方法重現性良好。

加樣回收試驗:精密稱取黃芩苷對照品適量，配成質量濃度為1.134 g/L的溶液，作為標準加樣貯備液。另精密稱取樣品(批號為091027)10 g，共6份，分別加入上述標準加樣貯備液0.7，1.0，1.2 mL，按供試品溶液制備方法制成加樣回收樣品液，取10 μL進樣，測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗結果(n=6)

2.2.4 樣品含量測定

依法測定3批樣品，結果黃芩苷含量分別為113.7，113.6，113.7 μg/g。

3 討論

薄層色譜法是含黃酮類成分中藥制劑最常用的定性分析方法。一般采用吸附薄層色譜，常用的吸附劑為硅膠與聚酰胺。聚酰胺特別適合于分離含游離酚羥基的黃酮及其苷類，黃芩苷正是含有游離酚羥基的黃酮苷類，故在樣品提取過程中使用聚酰胺柱吸附黃酮苷。洗脫時先用水洗去雜質，再用80%乙醇洗脫黃芩苷，以使鑒別效果理想。

關于高效液相色譜法測定黃芩中黃酮苷類成分的報道較多，多采用流動相梯度洗脫，且都選擇水、乙腈和無機酸類。試驗發現，甲醇、水和磷酸組成的流動相分離效果理想，且更為經濟。筆者通過二級管陣列檢測器，在200～400 nm波長范圍內對樣品進行光譜掃描，提取各組分在不同波長處的三維光譜圖進行對比分析，最后選280 nm作為測定波長。在此波長處被測組分有靈敏的響應值，同時此波長也是測定黃芩苷時雜質峰干擾最小處。

[1]解偉光.燒傷患者能量消耗的基本變化[J].醫學研究生學報，2007，20(3):269-271.

[2]劉英學，劉中剛，蘇 蘭，等.黃芩化學成分研究[J].中國藥物化學雜志，2009，19(1):59-62.

[3]張守堯，郭友立，王秉鈞，等.微乳液相色譜法測定黃芩苷的含量[J].南方醫科大學學報，2009，29(1):179-180.

[4]湯小蕾，孫平飛.HPLC法測定黃芩分散片中黃芩苷的含量[J].中藥材，2009，32(9):1 471-1 472.