痛風方劑顆粒質量標準研究＊

姚苑梅 ，徐玉紅，李 東，萬于軍

(1.廣東醫學院附屬福田人民醫院，廣東 深圳 518033;2.廣東省深圳市人民醫院·暨南大學第二臨床醫學院臨床藥學研究室，廣東 深圳 518020)

痛風方劑是臨床使用多年且經臨床觀察證實療效可靠的經驗方，治療痛風的總有效率在90%以上[1]。為便于攜帶和臨床應用，提高患者依從性，運用現代制藥技術對其進行了劑型改造，將其制成顆粒劑，并進行了動物藥效學研究[2]。為保證制劑質量的穩定、可控，確保臨床療效，根據醫院制劑報批要求，對其質量控制方法進行了研究，報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括G1311A四元泵，G1322A真空脫氣機，G1315B-DAD檢測器，D1316A柱溫箱，rheodyne-7725i手動進樣器，ChemStation色譜工作站;UV-2201型紫外分光光度計(日本島津);ZF-Ⅰ型三用紫外分析儀(365 nm，上海顧村電光儀器廠);CQX25-06型超聲波清洗器(上海必能信超聲波有限公司);AG285型電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)。痛風方劑顆粒(醫院制劑室制備，10 g/包，每克含量相當于原藥材2.25 g，批號分別為20100817，20100912，20101106);粉防己堿對照品(批號為 110711-200507)、防己諾林堿對照品(批號為 110793-200605)、鹽酸小檗堿對照品(批號為110713-200609)均由中國藥品生物制品檢定所提供;防己、黃柏、當歸對照藥材由深圳市藥品檢驗所提供。薄層層析硅膠G(青島海洋化工廠);甲醇、乙腈為色譜純，水為純化水，其余輔料均符合藥用標準，試劑均為分析純。所有試液使用前均經0.45 μm微孔濾膜過濾。

2 方法與結果

2.1 性狀

按痛風顆粒劑制備工藝和處方量制備3批樣品，觀察描述制劑的外觀性狀。本品為棕黃色顆粒，氣微，味苦澀。

2.2 檢查

3批樣品按2005年版《中國藥典(一部)》附錄ⅠC顆粒劑項下有關的各項規定進行檢查，結果符合規定[3]。

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1 防己[3-4]

取痛風顆粒3 g，加70%乙醇30 mL溶解，加入濃氨水2 mL，超聲提取20 min，再加氯仿20 mL萃取，取氯仿層，40℃水浴揮干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取不含防己的陰性樣品3 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取防己對照藥材2 g，加70%乙醇30 mL，同法制成對照藥材溶液。另取粉防己堿、防己諾林堿對照品，用甲醇溶解制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[3]，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉(含1%氫氧化鈉)為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷-氯仿-甲醇(7.5∶4∶2)為展開劑，在室溫下展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應位置上分別顯相同顏色的橙黃色斑點，陰性對照品溶液無干擾(圖1 A)。

圖1 薄層色譜圖

2.3.2 黃柏[3]

取痛風顆粒5 g，加1%醋酸甲醇溶液30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液40℃水浴揮干，用甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取不含黃柏的陰性樣品5 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取黃柏對照藥材0.5 g，加1%醋酸甲醇溶液，同法制成對照藥材溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，以甲醇制溶解制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。照薄層色譜法試驗[3]，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，置氨蒸氣預飽和的層析缸內，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑，在室溫下展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的黃色熒光，陰性對照品溶液無干擾(圖1 B)。

2.3.3 當歸[3，5]

取痛風顆粒5 g，加乙醚40 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液40℃水浴揮干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含當歸的陰性樣品5 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。另取當歸對照藥材1 g，加乙醚40 mL，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗[3]，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，在室溫下展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上分別顯相同顏色的藍色熒光，陰性對照品溶液無干擾(圖1 C)。

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件與系統適用性試驗[6-8]

色譜柱:Kromasil C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:含 0.6% 三乙胺的0.01 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調pH至3.0)-甲醇-乙腈(50∶20∶30);流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;檢測波長:280 nm;進樣量:20 μL。在此色譜條件下，防己堿和樣品中其他組分色譜峰達到基線分離，理論板數按計應不低于4 000，色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.4.2 溶液制備

精密稱取干燥至恒重的粉防己堿對照品10.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得質量濃度為100.0 μg/mL的對照品貯備溶液。取本品內容物適量，研細，取約2.0 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入氨試液2 mL，加甲醇近刻度，超聲(功率160 W，頻率40 kHz)處理20 min，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，置中性氧化鋁柱(100～200目，5g，內徑1.5 cm)上，用甲醇 40 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣用甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。制備缺防己的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.4.3 方法學考察

專屬性考察:分別精密吸取2.4.2項下3種溶液各20 μL，按上述色譜條件進樣。結果表明，供試品溶液中粉防己堿的保留時間與對照品溶液一致，約為6.2 min，按樣品處理方法處理后，粉防己堿與其他成分達到基線分離，陰性對照品溶液沒有干擾(圖2)。

線性關系考察:分別精密量取質量濃度為100.0 μg/mL的對照品溶液 1，2，4，6，8，10 mL，置 25 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述條件分別進樣20 μL。以質量濃度(C)為橫坐標、相應的峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 A=15.26C+0.68(r=0.999 8)。結果表明，粉防己堿質量濃度在4.0～40.0 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:取質量濃度為24.0 μg/mL的對照品溶液，重復進樣6次，測定峰面積。結果的 RSD為0.89%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，每隔1 h進樣1次，連續測定12 h。結果的 RSD=1.27%，表明供試品溶液至少在12 h內穩定。

重復性試驗:取同一批(批號為20101106)樣品，按樣品含量測定方法操作。結果平均含量為0.223 7 mg/g，RSD=1.86%(n=6)。

加樣回收試驗:稱取已知含量的樣品(批號為20101106)1.0 g共9份，分別按低、中、高3個量級加入粉防己堿對照品，按含量測定方法進行測定，記錄峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 粉防己堿加樣回收試驗結果(n=9)

2.4.4 樣品含量測定

取3批樣品，每批平行取樣3份，按溶液制備項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣20 μL進行測定，計算含量。結果3 批樣品含量分別為 235，218，224 μg/g。

3 討論

進行薄層鑒別時，按中醫組方理論選取方中主藥且化學成分明確、藥理研究較為透徹的防己、黃柏、當歸3種藥材做鑒別[9-11]。在選擇展開條件時，各藥材均首先按藥典規定的展開條件進行試展開，但由于組方中藥材較多，可能存在各化學成分相互影響的現象，藥典收載的展開劑系統并不能完成適用于本組方中的藥材鑒定，為達到高質量的鑒別效果，對展開劑進行了試驗性調整。

在鑒別防己時，先后對三氯甲烷-丙酮-甲醇(6∶1∶1)、氯仿-乙酸乙酯-甲醇(7∶2∶1)、正己烷-氯仿-甲醇(7.5∶4∶2)3個展開劑系統進行預試驗，第1個系統無斑點顯示，第2個系統展開后斑點較為擴散。采用含1%氫氧化鈉的羧甲基纖維素鈉鋪板，以正己烷-氯仿-甲醇(7.5∶4∶2)為展開劑，取得了較好展開效果，且展開重復性好;供試品溶液在堿性條件下以三氯甲烷提取后，斑點更為清晰。

鑒別黃柏時，使用2005年版《中國藥典(一部)》黃柏藥材項下的鑒別方法，供試品溶液對應位置無黃色斑點或熒光顯示，借鑒2000年版《中國藥典(一部)》黃柏藥材項下的展開劑系統[12]，分離效果得到改進，但有干擾，試用正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑后，展開斑點較清晰。展開前用氨蒸氣飽和后，可明顯提高展開速度，熒光斑點更為清晰。

鑒別當歸時，最初使用藥典當歸藥材項下的展開劑系統正己烷-乙酸乙酯，但斑點過大，存在拖尾現象，將正己烷改為石油醚，以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，效果明顯改善。

采用文獻報道的粉防己堿含量測定方法[8-10]，粉防己堿保留時間較長，改用C8柱后可縮短分析時間，特別是加入三乙胺后，峰形得到明顯改善。試驗中考察了不同樣品處理方式對含量測定結果的影響，結果發現以適量氨水堿化樣品后，可明顯提高待測樣品的溶出量。為消除其他成分的干擾，試驗采用中性氧化鋁柱對樣品進行分離濃縮。

本研究表明，所建立的薄層色譜鑒別法和高效液相色譜法專屬性強、重復性好，可滿足痛風方劑顆粒的質量控制要求。

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