具抑菌活性的魚腥草內生細菌的篩選＊

胡汝曉，謝丙炎，譚周進，王春暉

(1.湖南省食用菌研究所，湖南 長沙 410013;2.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081;3.湖南中醫藥大學基礎醫學院，湖南 長沙 410208)

魚腥草為三白草科多年生草本植物蕺菜 Houttuynia cordate Thunb.帶根全草，又名側耳根、紫蕺、豬鼻孔、九蓮草等，廣泛分布于我國中部、東南及西南各省區，具有抗菌、抗病毒、清熱解毒、消癰排膿、尿通淋之功效，中醫用于治療肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢、熱淋、癰腫瘡毒等病癥[1]。植物內生菌可從多個層面影響其化學成分:獨自合成化學物質[2-4]，協助植物合成化學物質[5-6]，影響植物合成與降解化學物質[2，5，7-8]。此外內生菌整體對植物化學成分也有影響[9]，還可從進化水平上影響植物的化學成分[3，10]。從具有獨特藥用價值或生物多樣性較為豐富地區生長的植物中較易分離出具有特殊代謝產物的菌株[11-14]，同時能克服植物資源的不足，而魚腥草正可滿足這些要求。魚腥草素對卡他球菌、溶血性鏈球菌、流感桿菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯的抑制作用[15]。魚腥草含有大量的內生菌，在尋找抗性微生物時，莖內生菌具有一定的優勢[16]。因此，筆者以莖內生細菌為篩選抗性菌的重點，希望找到一些能合成魚腥草素或其類似物的具有開發潛力的菌株。

1 材料與方法

1.1 主要材料

CR21G型高速冷凍智能離心機(日本日立公司);UV-2100型雙光束紫外/可見分光光度計(中國北京瑞利分析儀器公司)。接種和培養儀器為國產，培養基Ⅰ配方為牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，瓊脂 1.8 g，蒸餾水 100 mL，pH=7.0 ～7.6;培養基Ⅱ為培養基Ⅰ不加瓊脂[17]。所用試劑為國產分析純。魚腥草采自湖南長沙周邊菜園，生長環境為地下水位高、常年潮濕的地塊;大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由本實驗室提供。

1.2 內生菌分離

將魚腥草連根挖起，先洗凈根上泥土，再沖洗整株，室溫下涼干表面明水，用無菌剪刀將根莖葉剪開，各取5 g，用75%酒精表面消毒5 min，然后用無菌水沖洗5次，取最后一次沖洗液(0.1 mL)涂布培養基Ⅰ平板，28℃下培養24 h，作為空白對照。在無菌條件下加10 mL無菌的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH=7.8，W/V=1/2)碾磨樣品，充分振蕩15 min，以此為母液，梯度稀釋至10-1，10-2，10-3，吸取菌液(0.1 mL)涂布培養基Ⅰ平板，28℃下培養24 h，根據外觀形態特征，挑選單菌落一步純化，做初步鑒定并保存。

1.3 點接法抑菌試驗[18]

取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，用培養基Ⅰ培養，無菌操作，挑取適當菌量到裝有無菌水的試管，打散搖勻制成菌懸液，取0.2 mL該菌懸液涂布培養基Ⅰ空白平板，放置20～30 min(至平板表面無明顯菌液)，作為檢測平板備用。用接種環挑起芝麻大小的被檢菌，接到檢測平板上，28℃下培養24 h，觀察有無抑菌圈。抑菌效果強弱用抑菌圈內外徑之比表示。

1.4 發酵液濾紙片法抑菌試驗[18]

取點接效果最好的一株菌株進行研究。具體操作為按檢測平板制作方法制取檢測平板。用培養基Ⅱ將目標菌在30℃和145 r/min條件下培養72 h(或處理后發酵液)，用細菌過濾器(孔徑為0.22 μm)過濾，用3層無菌干燥的小濾紙片(直徑為6 mm)蘸取無菌發酵液，置檢測平板上，28℃下培養24 h，觀察有無抑菌圈，用抑菌圈外徑 d(mm)表示抑菌作用強弱。

1.5 抗菌物質初步鑒定試驗

發酵液制取:將目標菌接入培養基Ⅱ，在30℃和145 r/min條件下培養72 h，以 5 000 r/min轉速(R20A2)離心 10 min，取上清液。

耐溫試驗:200 mL 發酵液，分別在 60，70，75，80，90 ℃下處理10 min，用濾紙片法做抑菌試驗。

抗菌物質透析試驗:取200 mL發酵液，裝于5 000 Da透析袋，放入聚乙二醇(PEG-6000)中，4℃下濃縮至1/10體積，再在4℃蒸餾水中透析至AgNO3檢測無沉淀(18 h)，取透析袋中蛋白溶液，用濾紙片法做抑菌試驗。

光吸收試驗:取1 000 mL發酵液，55℃下旋轉蒸發濃縮至100 mL，加300 mL無水乙醇，以10 000 r/min轉速(R12A3)離心10 min，取上清，55℃下旋轉蒸發濃縮至100 mL，以培養基Ⅱ同法操作溶液作為參比液校正基線，在200～800 nm波長范圍內以2 nm為間隔進行掃描。將做完光吸收試驗的溶液再在55℃下旋轉蒸發濃縮至固體，加50 mL蒸餾水溶解，用濾紙片法做抑菌試驗。

1.6 種屬鑒定試驗

按文獻[17]方法，做目標菌的菌落形態，革蘭氏染色和芽胞染色，鞭毛染色和細菌大小測定，糖、醇、糖苷類碳源的分解，淀粉水解，過氧化氫酶，明膠液化等試驗。

2 結果與分析

2.1 魚腥草內生菌的抗菌性特點

本試驗分離出200個細菌菌株，由點接法測得結果。魚腥草內生菌的抗菌性特點見表1。可見，剛分離時抗大腸桿菌和抗金黃色葡萄球菌株數比較接近，保存6個月并培養數代后抗菌菌株有所減少，且對大腸桿菌的抗性較易喪失，這就要求在篩選菌株中應重點關注對大腸桿菌抗性的穩定性。同時，可發現魚腥草內生菌對兩種菌的抗性具有連鎖性，說明找到同時抗兩種菌的物質是可能的。經點接法初選、濾紙片復選，筆者以抑菌圈內外圈之比、抑菌是否徹底、抑菌穩定性和形態差異性等為指標，從200個菌株中選出1個各項指標表現均較優良的細菌菌株。

表1 魚腥草內生菌的抗菌性特點[株(%)]

2.2 目標菌抗菌能力

由表2可見，目標菌抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的能力(抑菌圈內外徑之比)分別為3.28和3.8，由于不同菌株在相同培養條件下菌落直徑有較大差異(2～11 mm)，因此篩選抗性菌株時不能只考慮抑菌圈內外徑之比，對抑菌圈內徑較大的菌株，還得考慮內外徑之差。所選菌株菌落直徑為5～7 mm。試驗還表明，有些目標菌在對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用的同時，大腸桿菌或金黃色葡萄球菌對目標菌也有一定的抑制或促進作用，即目標菌在抑菌試驗中的菌落大小與純培養試驗中菌落大小(培養條件相同)有明顯差異。

表2 目標菌抑菌能力

2.3 目標菌發酵液抑菌能力

以濾紙片法抑菌試驗的抑菌效果差異不大，約為10 mm(濾紙片直徑6 mm)。這主要是因為濾紙片所蘸發酵液量比較一致，放到無水平板上時，發酵液擴散直徑比較一致，所以抑菌物質作用的范圍也比較一致，但在作用時間以及抑菌是否徹底上存在較大差異。所選菌株抑菌時間在5 d以上，且抑菌徹底。

2.4 抗菌物質光吸收特性

發酵液光吸收特征見圖1。可見，該菌株發酵液的初提液在魚腥草素最大吸收峰283 nm波長[19-20]附近有特征吸收峰，說明目標菌確實分泌物質到發酵液中，至于該物質是不是抑菌物質、是何種物質，還有待于進一步研究。

圖1 發酵液光吸收特征

2.5 抑菌物質初步鑒定結果

耐溫試驗表明，抗菌物質對高溫有較好的耐受性，在90℃水浴中10 min活性無明顯變化。透析試驗表明，發酵液經適當濃縮再透析后，透析袋中蛋白質等大分子物質無抑菌活性，說明抑菌物質為能透過透析袋的小分子物質，而不是留在透析袋中的蛋白質等大分子物質。結合耐溫試驗結果，可以初步判定該菌產生的抗菌物質不是常規的蛋白質類物質。經光吸收試驗初處理后的提液基本上沒有失去抗菌活性，即抗菌物質在初處理過程中大量保留于提取液中。

2.6 種屬鑒定

目標菌菌落形態為煎餅狀、不透明、褐色、表面濕潤、邊緣完整的直徑為2 mm的圓形菌落;革蘭染色、芽胞染色陽性，鞭毛染色陰性細菌大小為 0.75 μm ×2.4 μm;葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、木糖、阿拉伯糖反應陽性，甘露醇反應陰性;淀粉水解試驗陽性;過氧化氫酶試驗陽性;明膠液化試驗陽性。根據細菌分類學的標準可知，目標菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)[21]。

3 討論

本試驗沒采用最優稀釋濃度，而是采用最大濃度范圍，即只要有單菌落出現就進行分離，而不管該平板上菌落是否出現相連情況。這主要基于在分離過程中內生菌可能繁殖，而這種體外繁殖的菌株間速率比與體內繁殖的菌株間速率比可能不同，即分離過程表現為的優勢菌落可能并非實際的優勢菌。同時尤其注重相似菌株的篩選，如果兩菌大部分形態指標相似，但有一兩個形態指標明顯不同，即被成對選出，并在后期試驗中進行對比研究。

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