豬戊型肝炎病毒雙重RT-PCR檢測診斷方法的建立及其應用

郝寶成,蘭 喜,胡永浩,柳紀省,,梁劍平,

(1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所中國農業科學院新獸藥工程重點開放實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室,甘肅蘭州730050;2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所,甘肅蘭州730046;3.甘肅農業大學動物醫學院,甘肅 蘭州 730070)

豬戊型肝炎(HE)是近年來頗受人們關注的一種人畜共患傳染病。人普遍易感。急性戊型肝炎病情較重,病死率為2.5%,明顯高于甲型(0.1%)和乙型(0.9%)肝炎,孕期婦女死亡率可高達15%～20%[1],尤其是懷孕最后3個月的孕婦病死率更高。1986～1988年我國新疆南部地區曾發生HE水源性大流行,共計有119 280人發病,死亡707人,是迄今世界上最大、最嚴重的一次戊型肝炎流行[2]。

豬作為HEV的貯存宿主,在人類病毒性肝炎的流行病學中具有重要的地位,對于公共衛生、異種器官移植和食品安全等構成潛在的威脅[3]。因此,在加強對豬戊型肝炎的預防控制方面,快速準確的檢測和注射疫苗將是最為有效的防控手段。目前,對于病毒性疫病的診斷一般采用病原分離鑒定和血清學方法 ,但這些方法存在操作繁雜、費時費力、敏感性較差等不足,特別是當動物感染多種病原時,難以應用常規方法進行早期快速檢測。由于目前商業化的HEV抗體診斷試劑以Ⅰ型HEV抗原為主,在臨床檢測中可能存在不同基因型樣品的漏檢現象,所以有必要針對不同基因型建立有效﹑快速的檢測診斷方法。

1 材料與方法

1.1 病毒 病料1～217號為豬糞便樣品,218～255號為豬膽汁血清樣品,采集自甘肅省不同地區豬養殖場。

1.2 主要試劑 病毒RNA小量制備試劑盒購自QIAGEN公司;T反應試劑盒 、TaKaRa TaqTM、100 bp DNA Marker 、λ-EcoT14、質粒抽提試劑盒 、DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司;限制性內切酶BamHⅠ、SphⅠ購自Promega公司;E.coli DH5α感受態細胞由本實驗室保存。

1.3 引物設計 根據GenBank收錄的 HEV ORF2基因序列,參照設計1對特異性引物,引物由TaKaRa公司合成。其序列為:E01:5′-TGGCGTTCG(A/T)GTTGAGA-3′;E02:5′-GGT(C/G)GTC(G/T)GCT(G)GAGGAGGAG-3′;E03:5′-CCGACQAAATCAAT TCTGTC-3′;E04:5′-T TG(A)TCCTGCTGA(T)GCG(A)T TCTC-3′

1.4 病毒RNA的提取 依次取病料樣懸液1～255號,10 000 r/min離心3 min,取上清液,病毒RNA小量制備試劑盒抽提病毒RNA。上述步驟均在BPL3實驗室進行。

1.5 cDNA的合成 在0.2 mL EP管中依次加入5 ×RT Buffer 4 μ L,RNase Free ddH2O 3.5 μ L,dNTP Mixture(各 10 mmol/L)1 μ L,RNase inhibitor 1 μ L,AMV Rverse Tran-scriptase 0.5 μ L(5 U/μ L),RNA 樣品 10 μ L,反應總體積為 20 μ L。反轉錄條件:42℃60 min,70℃15 min。

1.6 PCR擴增 反轉錄液3 μ L,10×PCR緩沖液2.5 μ L,25 mmol/L MgCl22 μ L,用 10 mmol/L dNTPs 1 μ L,2 個外引物各 0.5 μ L(20 pmol/μ L),Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)0.25 μ L,ddH2O 調整終體積至50 μ L。取第一輪PCR 產物1 μ L,2個內引物各0.5 μ L(20 pmol/μ L),其余成分與第一輪PCR反應相同,進行第二輪PCR反應。按反應程序 :94℃、2 min;94 ℃、30 s,50℃、30 s,72℃、2 min 30 s,共35個循環;72℃延伸15 min,PCR產物用1%瓊脂糖電泳觀察(見圖1、圖2)。擴增后未獲得產物的樣品,在進行套擴以后仍沒有獲得目的條帶大小的樣品的同時,調整擴增條件再次確認。對于擴增所得條帶與目的條帶大小可疑的樣品繼續進行下一步克隆鑒定。

1.7 cDNA克隆與鑒定 PCR產物按小量膠回收試劑盒回收,與 pMD20-T載體連接(體系:pMD20-T 1μ L,Ligation solution I 5.0 μ L 、DNA樣品4.0 μ L)輕輕混勻后,16℃連接過夜,連接產物按常規方法轉化E.coli DH5α感受態細胞,涂布于含Amp、X-Gal及IPTG的鑒別培養基,挑取藍斑作陰性對照提取質粒初選陽性菌落培養,用質粒PCR以及用BamHⅠ+SphⅠ進行酶切鑒定,酶切體系為:BamH Ⅰ1.0 μ L 、Sph Ⅰ1.0 μ L 、質粒 DNA 16 μ L 、10 ×K Buffer 2.0 μ L 、總體積 20.0 μ L,37 ℃水浴酶切5 h,以1%瓊脂糖電泳分析酶切結果。鑒定的重組質粒依次命名為pMD-1～pMD-x。

1.8 序列測定和比較分析 將陽性重組質粒送上海英駿生物技術有限公司測序。將所測序列登陸GenBank,確定是否為豬戊型肝炎病毒陽性。

2 結果

對所采集的255份樣品,經 RT-PCR檢測,共有豬戊型肝炎病毒陽性12份,陽性率為4.71%。表明甘肅省養殖豬中存在豬戊型肝炎病毒的感染,見圖1、圖2及表1。

表1 255份疑似豬戊型肝炎病毒樣品RT-PCR檢測結果統計

在鑒定樣品中,豬糞樣21,39,54,73,79,80,126,136,189號樣為陽性樣品,豬膽汁血清樣中219,226,227號樣為陽性樣品。

3 討論

戊型肝炎主要通過糞便污染途徑傳播,近年來隨著對戊型肝炎研究的深入,發現還通過母嬰傳播。Khuroo[4]等報道了新生兒由于母嬰傳播而感染的案例,感染率為78.9%。另外研究表明,HEV不僅感染人,而且可以感染豬、野豬、雞、鳥[5]、鼠[6]、貓[7-8]及鹿等動物,人也可以通過生吃鹿肉而染病[9-10],提示人畜是HEV的共同宿主。

HEV基因有 3個開放閱讀框(open reading frames,ORFs),ORF2為主要的結構基因編碼區,長約2kb,其被認為是最保守的區域,其核苷酸序列也最保守。本文利用DNAMan軟件對GenBank登錄的戊型肝炎病毒4個主要基因型代表株的序列進行分析,選擇其高度保守的ORF2區域設計合成套式引物,對在甘肅地區采集的255份豬糞便或豬膽汁血清樣品,進行了檢測診斷。試驗共檢驗255份豬糞便或豬膽汁血清樣品,檢出陽性數為12份,陽性率為4.71%。其中豬糞便樣﹑豬膽汁血清樣陽性率分別為4.15%﹑7.89%,本次檢測診斷結果表明,在甘肅省的養殖場豬群中存在豬戊型肝炎的感染。樣品采集為隨機采樣,檢出陽性樣品后在同一豬群中按量采樣,上表中所列的陽性率與報道的流行率7%～15%比較接近,可以作為一個HEV流行率研究的參考。

目前,國內外專家學者已對豬戊型肝炎的病原學、流行病學、實驗室診斷、基因結構等方面研究取得了重大進展。但對豬戊型肝炎的發病機理尚需進一步的研究。對其發病機理的研究,是進一步開發診斷試劑盒和建立有效預防控制機制的基礎。

[1]Purdy M A,Carson D,McCaustland K A,et al.Viral specificity of hepatitis E virus antigens identified by fluorescent antibody assay using recombinant HEV proteins[J].J Med Virol,1994,44:212-214.

[2]Zhuang H,Cao X Y,Liu C B,et al.Epidemiology of hepatitis E in China[J].Gastroenterologia Japanica,1991,26(Suppl.3):135-138.

[3]周錦萍,曾榮譽,孫泉云,等.豬戊型肝炎研究進展[J].動物醫學進展,2006,27(8):52-55.

[4]Khuroo M S,Kamili S.Clinical course and duration of viremia in vertically transminttied hepatitis E virus(HEV)infection in babies born to HEV-infected mothers[J].J Viral Hepa,2009,16(7):519-523.

[5]Sun Z F,Larsen C T,Dunlop A,et al.Genetic identification of from healthy chicken flocks and characterization of the capsidg from chickens with hepatitis splenomegaly syndrome in different United States[J].J Gert Virol,2004,8(Pt3):693-700.

[6]Hirano M,Ding X,Li T C,et al.Evidence for widespread among wide rats in Japan[J].Hepatol Res,2003,27(1):1-5.

[7]Okamoto H,T akahashi M,Nishizawa T,et al.Presence of an Japanese pet cats[J].Infection,2004,32(1):57-58.

[8]Choi C,Ha S K,Chae C.Development of nested RT-PCR hepatitis E virus in formalin-fixed,paraffin-embedded tissues hybridization[J].J Virol Methods,2004,115(1):67-71.

[9]T ei S,Kitajiama N,Takahashi K,et al.Zoonotic transmission to human beings[J].The Lancet,2003,362(9381):371-373.

[10]郝寶成,蘭喜,柳紀省,等.豬戊型肝炎病毒 swCH-GS189株ORF2基因的克隆及序列分析[J].生物技術通報,2009,5:122-126.