槲皮素固體脂質(zhì)納米粒的制備與含量測(cè)定

常明泉，孫運(yùn)娥，蔣安榮，王剛

(湖北醫(yī)藥學(xué)院1.附屬太和醫(yī)院藥學(xué)部;2.藥檢學(xué)院，湖北十堰 442000)

固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanopartcles，SLN)具有細(xì)胞親和性、靶向性、緩釋性、低毒性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)，藥物制成脂質(zhì)體可大大提高生物利用度［1］。槲皮素是天然黃酮類化合物，在一些植物藥如蘆丁、槐米、紅棗、桑葉、三七中以苷的形式存在，通過細(xì)胞增殖和血管新生相關(guān)信號(hào)通路的復(fù)雜作用而對(duì)腫瘤表現(xiàn)出化學(xué)預(yù)防作用［2］。為了更好地發(fā)揮槲皮素的藥理作用，筆者在本實(shí)驗(yàn)中將槲皮素制成SLN，并采用高速離心-高效液相色譜法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 KWY-102型電熱減壓干燥箱(武漢市武昌實(shí)驗(yàn)儀器廠)，F(xiàn)A2004分析天平(上海精科天平廠，精度0.000 1 g)，TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪子華儀器制造廠)，UPS-200H型超聲波震蕩儀(500W，40 kHZ，南京熊貓電子儀器有限公司)，LG-冰箱(LTR-B2071GTBC)，戴安3000型高效液相色譜儀。

1.2 試藥 槲皮素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100081-200406)，槲皮素原料(十堰市武當(dāng)中醫(yī)藥研究所，批號(hào):20100414，藥用級(jí)，純度:99.1%)，山崳酸甘油酯(武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào):20100305，藥用級(jí))，大豆卵磷脂(武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào):20100310，藥用級(jí))，膽固醇(武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào):20100305，藥用級(jí))，丙酮(武漢市江北化學(xué)試劑廠，批號(hào):20080407，分析純)，泊洛沙姆(武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào):20100315，藥用級(jí))，聚乙二醇(PEG2000-DSPE，武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào):20100307，藥用級(jí))。三氯甲烷(洛陽(yáng)化學(xué)試劑廠，批號(hào):20080224，分析純)，聚山梨酯 80(吐溫-80，上海化學(xué)試劑廠，批號(hào):20081006，分析純)，無(wú)水乙醇(武漢市洪山中南化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20091106，分析純)，甲醇、乙酸均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 槲皮素SLN的制備［3-4］分別稱取山崳酸甘油酯0.1 g，膽固醇0.1 g，大豆卵磷脂0.2 g，置適宜燒杯中，于75℃水浴中熔融做為油相;量取丙酮、三氯甲烷各6 mL混勻，稱取槲皮素20 mg加入丙酮-三氯甲烷混合液中溶解做為有機(jī)相;將有機(jī)相與油相混合均勻75℃保溫;稱取泊洛沙姆0.1 g，聚乙二醇0.1 g，聚山梨酯80 1 mL，純化水13 mL，置適宜燒杯中于75℃水浴上加熱溶解作為水相;在磁力攪拌狀態(tài)下(600 r·min-1)用帶有6號(hào)針頭的適宜注射器吸取油相緩緩注入水相中(2 mL·min-1)，繼續(xù)攪拌120 min乳化包封，濃縮到原體積的1/2時(shí)，將燒杯移入另一盛有2℃冰水的磁力攪拌器中，繼續(xù)攪拌固化60 min，即得槲皮素SLN。

2.2 槲皮素含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件［5］Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-4.3% 乙酸溶液(55∶45);流速 1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 溶液的制備 ①對(duì)照品溶液的制備:精密稱取在105℃減壓干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品20.0 mg，于100 mL容量瓶中加無(wú)水乙醇超聲溶解，定容，即得200 μg·mL-1儲(chǔ)備液。②樣品溶液的制備:取槲皮素SLN樣品1.0 g，精密稱定，置于50 mL平底燒杯中，加無(wú)水乙醇約15 mL超聲破乳分散，溶液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇分次洗滌燒杯 3次(10，10，10 mL)，洗液并入容量瓶中，定容，搖勻，取混合溶液適量于高速離心機(jī)中1.6×104r·min-1離心15 min，取上清液用孔徑0.45 μm微孔濾膜過濾即得。③陰性樣品溶液的制備:精密稱取不含槲皮素的陰性樣品1 g，按樣品溶液的制備方法處理，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別吸取“2.2.2”項(xiàng)下制備的各樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣。結(jié)果對(duì)照品溶液、樣品溶液均在相同位置有吸收峰出現(xiàn)，陰性樣品溶液無(wú)吸收，說明制劑中的輔料對(duì)槲皮素測(cè)定不產(chǎn)生干擾。見圖1。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取槲皮素對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL 至10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得 20.0，40.0，80.0，120.0，160.0，200.0 μg·mL-1對(duì)照品溶液，精密吸取 20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)操作3次，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得曲線方程為:A=1.343 5C–1.490 4(r=0.999 6)，槲皮素在2.0～200.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取濃度為80.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5次，測(cè)定槲皮素的峰面積，計(jì)算含量，RSD為1.12%(n=5)。

圖1 HPLC色譜圖A.陰性樣品溶液;B.對(duì)照品溶液;C.樣品溶液;1.槲皮素Fig．1 HPLC chromatogramsA.negative sample;B.reference substance;C.sample solution;1.quercetin

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取濃度為80.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，于5 ～10 ℃的冰箱中保存，在 0，4，12，24，36，48 h分別取樣，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定槲皮素的含量，其RSD為1.62%。

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 平行精密稱取5份樣品，各1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法②制備供試品溶液，按“2.2.9”項(xiàng)下方法在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)得槲皮素平均含量為 10.48 μg·g-1，RSD=1.80%(n=5)，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測(cè)知含量的槲皮素SLN樣品(批號(hào):20100415)9份，每份0.5 g，精密稱定，分3組，每組3個(gè)樣品，分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液(200.0 μg·mL-1)0.1，0.2，0.3 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下②的方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定槲皮素的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.9 含量測(cè)定 取樣品3批，各1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下②樣品溶液制備方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定槲皮素的含量，結(jié)果批號(hào)為20100410，20100415，20100422 的樣品，槲皮素含量分別為 9.91，10.24，10.72 μg·g-1，RSD 分別為1.72%，1.41%，1.36%。

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備槲皮素SLN，主藥槲皮素不溶于水，先將其加入丙酮-三氯甲烷(1∶1)組成的有機(jī)相中溶解后，再加入油相中混合，加入2.5%的聚山梨酯80做乳化劑，以山崳酸甘油酯、膽固醇、大豆卵磷脂為載體材料，在文中實(shí)驗(yàn)條件下制得的SLN穩(wěn)定性好，包封率達(dá)80.2%。

表1 槲皮素SLN加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．1 Recovery of quercetin SLN n=9

本實(shí)驗(yàn)采用高速離心-高效液相色譜法測(cè)定SLN的含量，在處理樣品溶液時(shí)，加入無(wú)水乙醇超聲不僅能夠破乳促進(jìn)分散，而且使槲皮素被其充分溶解便于檢出;實(shí)驗(yàn)時(shí)曾參考文獻(xiàn)方法［6］以甲醇-0.4%磷酸水溶液(51∶49)為流動(dòng)相檢測(cè)，但出峰效果不理想，始終有拖尾現(xiàn)象，考慮到本實(shí)驗(yàn)工作量大，樣品多，為了減少水相中磷酸對(duì)色譜柱的侵蝕，延長(zhǎng)其使用壽命，實(shí)驗(yàn)改用多梯度濃度的的乙酸溶液與甲醇配比做流動(dòng)相，結(jié)果以甲醇-4.3%乙酸溶液(55∶45)為流動(dòng)相時(shí)，峰形對(duì)稱，樣品分離效果良好，結(jié)果重復(fù)性好。

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