由Id1介導(dǎo)的MMP-2、MMP-9對胃癌生成的調(diào)控作用

雷婷 韓霜 郭雪艷 丁杰

1.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院消化病中心，新疆 烏魯木齊 830000；

2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化病院，全軍消化病研究所腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，陜西 西安 710032；

3.陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710068

腫瘤的發(fā)生與維持離不開新生血管的形成，腫瘤細(xì)胞的侵襲更依賴于腫瘤內(nèi)新生血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。尋找一個合適新生血管的靶標(biāo)，是治療腫瘤的關(guān)鍵。目前認(rèn)為分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1，Id1)是一種準(zhǔn)原癌基因的侯選分子和促血管生成因子，多項研究提示其表達(dá)在腫瘤的血管生成過程中可能起著重要作用［1］。Id是螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)轉(zhuǎn)錄因子亞家族的一個成員，通過影響其下游分子的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用［2］，但其參與血管生成的具體機(jī)制尚不明確。

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基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和基底膜重塑所必需的條件，目前認(rèn)為MMPs并不僅僅只降解ECM成分，其更多的是作用于血管的發(fā)生。MMPs幾乎在所有的人類腫瘤中廣泛而大量表達(dá)，大量研究證實(shí)MMPs的高水平表達(dá)與腫瘤的侵襲和(或)轉(zhuǎn)移能力以及不良預(yù)后有關(guān)，并在腫瘤的血管生成中起著決定性作用［3］。有報道提出，在Id1基因敲除的鼠胚胎纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)上清中MMP-2的活性下降［4］。本研究著重探討了Id1通過調(diào)控MMPs發(fā)揮促胃癌生成的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

Id1兔多克隆抗體為Santa Cru z 公司產(chǎn)品；MMP-2、MMP-9兔多克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品；β-actin鼠單抗為Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)胞總RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司；Id1、MMP-2和MMP-9引物根據(jù)軟件設(shè)計由北京三博遠(yuǎn)志生物工程技術(shù)有限公司完成；一管便攜式PCR擴(kuò)增試劑盒(2×Taq PCR Mastermix)購自北京天為時代公司；SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

試劑盒購自MBI Ferments公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)和溴化乙錠(EB)購自Sigma公司；醋酸纖維素(NC)膜購自Hybond公司；蛋白分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)來自MBI Ferments公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；胰蛋白酶購自Hyclone公司；胎牛血清購自四季青公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；脂質(zhì)體LipofectmineTM2000購自Invitrogen公司；BamHⅠ、Hind Ⅲ、kpnⅠ和Hind Ⅲ酶購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測

經(jīng)Western blot和RT-PCR檢測可見，在Id1低表達(dá)的細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的蛋白水平(圖3)及mRNA水平(圖4)均下調(diào)，同時Id1抑制效率越高，MMP-2、MMP-9的表達(dá)越低。

1.2.2 Id1特異性siRNA的設(shè)計

用胰酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。通過裸鼠皮下注射0.2 mL的細(xì)胞懸液，8周后處死裸鼠。取出移植瘤，進(jìn)行移植瘤連續(xù)切片，HE染色觀測腫瘤形態(tài)。

1.2.3 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

合成編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA的正義鏈和反義鏈，分別取5 μL正反義寡核苷酸，20 μL 2×退火緩沖液，加入10 μL去離子水于95 ℃水浴中5 min。將退火后的雙鏈siRNA與酶切純化的pSilencer3.1載體于16 ℃連接過夜。以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選重組載體。擴(kuò)增白色的抗性菌落并提取質(zhì)粒，以BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定重組質(zhì)粒。收集酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒，送上海生工公司進(jìn)行DNA全長自動測序。

我在清代筆記中發(fā)現(xiàn)一個有趣的故事，說乾隆年間江蘇宜興有人研究老虎后，熬制了黏膠撒在老虎常常打滾的草叢里，而老虎愛干凈（這一點(diǎn)很像貓咪），不能忍受毛皮沾草，就舔啊舔，最終舔得煩躁，暴躁死掉。然后這個人就能比武松更輕松地獲得一只老虎。

用Origin7.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量資料實(shí)驗結(jié)果以表示，均數(shù)間的比較采用t檢驗；率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

按照LipofectamineTM2000 Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1天，將細(xì)胞接種于6孔板，約3×105/孔，待細(xì)胞達(dá)到80%融合。DNA定量后取2 μg，LipofectamineTM2000 5 μL，加無血清培養(yǎng)基500 μL。轉(zhuǎn)染6 h后，換含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)。

這個事件早在之前朋友圈發(fā)酵，甚至有人因此懷疑WSET認(rèn)證的價值是否不如從前。單靠一紙證書是否能夠全面地去了解一位從業(yè)者的知識能力水平？David Allen MW表示：“WSET 4級是一項非常認(rèn)真嚴(yán)肅的考試，而且整個課程經(jīng)過了極大的改進(jìn)，比25年前的文憑課程要困難得多。如果越來越多的中國人通過WSET Diploma，我認(rèn)為這并不意味著它沒有價值。相反，它支撐著葡萄酒教育，讓一些不學(xué)無術(shù)的人無法在葡萄酒行業(yè)中立足。我相信WSET也會采取措施來保持其聲望?！?/p>

1.2.5 采用Western blot檢測亞細(xì)胞克隆中MMP-2、MMP-9及Id1的表達(dá)

配制10%的分離膠和5%的積層膠，分離膠中加入10%的明膠溶液。凝膠制好后，25 mA恒流至溴酚藍(lán)前沿于分離膠最前端時，停止電泳。凝膠加入明膠緩沖液中溫育12～16 h。凝膠染色4 h，脫色1～2 h，至對照出現(xiàn)明顯清晰的負(fù)染酶帶。

1.2.6 RT-PCR鑒定亞細(xì)胞克隆MMP-2、MMP-9及Id1的表達(dá)

RT-PCR相關(guān)引物序列及產(chǎn)物見表1。RTPCR反應(yīng)條件：94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.2.7 ELISA檢測不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中的MMP-2、MMP-9蛋白含量

實(shí)驗過程中，我們同時轉(zhuǎn)染了多個Id1小干擾RNA，并依順序編號。與空載體轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞相比，Id1-siRNA可顯著下調(diào)Id1在SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)，反之Id1正義細(xì)胞中Id1的表達(dá)上調(diào)(圖2)。

1.2.8 明膠酶譜法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的活性

連鎖藥店承接基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)藥房職能可行性的調(diào)查分析 ……………………………………………… 周梅梅等（19）：2699

經(jīng)G418篩選12周后，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞亞系。收集約106對數(shù)生長期細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的三去污裂解，細(xì)胞總蛋白質(zhì)用Bradford方法蛋白定量；50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，剪下相應(yīng)蛋白電泳條帶，100 ml/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(Id1為1∶ 100，MMP-2為1∶400，MMP-9為1∶800)。4 ℃過夜，TBST緩沖液洗膜4次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠(羊抗兔)二抗，37 ℃溫育2 h，洗膜4次，ECL顯影。

1.2.9 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗

正義鏈：5’-GATCCACGTGCTGCTCTACG ACATTTCAAGAGAATGTCGTAGAGCAGCACGT TTTTTTGGAAA-3’；反 義 鏈：5’-AGCTTTTCC AAAAAAACGTGCTGCTCTACGACATTCTCTTG AAATGTCGTAGAGCAGCACGTG-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

1.2.4 Id1正義及siRNA的轉(zhuǎn)染

2 結(jié) 果

2.1 Id1和MMP-2，MMP-9在胃癌組織中的共表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果提示(圖1)，胃癌組織中Id1和MMP-2、MMP-9陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，胃癌組織中Id1和MMP-2、MMP-9共表達(dá)，MMP-2與Id1的共表達(dá)率為73.7%，MMP-9與Id1的共表達(dá)率為69.3%。

明曹學(xué)佺《蜀中廣記》卷六十三《方物記》第五：“黃山谷戎州與人帖：昨日市中已見臘梅，開者數(shù)枝矣。有詞曰：……右調(diào)《滿江紅》。自注：與夔州崔三伯禮侍御同作。”所引詞作即此。按此當(dāng)為陸游詞，《全宋詞》輯入陸游名下，題作《夔州催王伯禮侍御尋梅之集》。陸游在乾道六年十月至乾道八年正月期間，任夔州通判，與夔州知州王伯禮相友善。除此詞外，陸游另有《感皇恩·伯禮立春日生日》、《驀山溪·送伯禮》二詞，并為王伯禮作《王侍御生祠記》及《云安集序》。

2.2 Id1正義和siRNA轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞亞系的鑒定及Id1的表達(dá)

將細(xì)胞接種于6孔板，約3×105個/孔，細(xì)胞達(dá)到90%融合后，換無血清培養(yǎng)液。24 h后，分別取細(xì)胞上清液500 μL。參照人血清MMP-2、MMP-9酶聯(lián)免疫試劑盒，以1∶2的比例測定樣品D值(490 nm)，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析樣品的蛋白含量。

表 1 RT-PCR相關(guān)引物及產(chǎn)物Tab.1 The primers and products by RT-PCR

2.3 SGC7901/Id1-siRNA細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的蛋白及mRNA水平的變化

石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2溶液溫育。蒸餾水沖洗后，PBS振洗3次，3 min/次。滴加10%正常羊血清，37 ℃溫育20 min，滴加羊抗人Id1或MMP-2、MMP-9多克隆抗體一抗(Id1為 1∶ 100，MMP-2為 1∶ 100，MMP-9為1∶200)，4 ℃過夜。復(fù)溫后滴加1∶100兔抗羊二抗37 ℃溫育30 min；滴加SABC液體，37 ℃溫育20 min。加入新鮮配置DAB試劑，蘇木精襯染；脫水、透明。中性樹脂封片，在光鏡下行結(jié)果判斷。

會計工作作為企業(yè)日常工作中的重要組成部分，在各個企業(yè)單位正常順利的運(yùn)行中發(fā)揮著重要作用，而隨著我國信息技術(shù)的不斷發(fā)展完善，會計電算化打破了會計理念的傳統(tǒng)性，使其不再故步自封，使會計信息處理的速度和準(zhǔn)確性得到了充分的保障，對會計工作方法有些極其重大的影響，我們也應(yīng)當(dāng)將會計電算化更加徹底的作用到會計工作中來。

綜上所述，超聲引導(dǎo)下的胸神經(jīng)阻滯可為乳腺癌改良根治術(shù)患者提供良好的術(shù)后鎮(zhèn)痛，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，值得臨床推廣應(yīng)用。

2.4 SGC7901/Id1-siRNA細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9的表達(dá)

ELISA檢測結(jié)果提示，與空載體轉(zhuǎn)染SGC7901P細(xì)胞相比，Id1-siRNA細(xì)胞可顯著抑制MMP-2、MMP-9的釋放，并且Id1的抑制效率越高，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9的含量越低(圖5，P＜0.05)。

（3）造成諧波污染。在運(yùn)行的過程中，逆變器開關(guān)的反復(fù)開斷是一種難以規(guī)避的問題，如此一來，便會制造一個和開關(guān)頻率大小相等或者接近的諧波分量，進(jìn)而造成諧波污染問題。

2.5 Id1對MMP-2、MMP-9活性的影響

明膠酶譜法結(jié)果提示(圖6)，在SGC7901/Id1-siRNA細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的活性下調(diào)，同時Id1的抑制越強(qiáng)，MMP-2、MMP-9的表達(dá)越弱。

2.6 SGC7901/Id1-siRNA細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤組織中MMP-2及MMP-9的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，SGC7901/Id1-siRNA細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤組織中MMP-2及MMP-9的表達(dá)較SGC7901P細(xì)胞顯著減弱，同時對Id1的抑制越強(qiáng)，MMP-2、MMP-9的表達(dá)越低(圖7)。組織Western blot結(jié)果提示，成瘤組織中MMP-2、MMP-9的蛋白水平下調(diào)，并且在Id1抑制越高的成瘤組織MMP-2、MMP-9的表達(dá)越低(圖8)。

3 討 論

Id是bHLH轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員，包括Id1、Id2、Id3和Id4。與其他所有的bHLH不同的是Id蛋白缺乏堿性DNA結(jié)合域，因此與DNA結(jié)合只能形成無功能的異源二聚體而抑制bHLH因子的轉(zhuǎn)錄活性。4種Id蛋白在HLH區(qū)域有很強(qiáng)的同源性，因此在功能上有許多重復(fù)性。多項研究證實(shí)Id基因在人類多種原發(fā)性腫瘤中過表達(dá)，能夠誘導(dǎo)惡性腫瘤的發(fā)生，但尚未發(fā)現(xiàn)Id在基因水平的異常擴(kuò)增和突變，故現(xiàn)將其稱為準(zhǔn)原癌基因［5］。近幾年來對Id基因在腫瘤方面的研究越來越深入，大量實(shí)驗表明，Id蛋白在惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及浸潤等過程中發(fā)揮重要作用，尤其以其與腫瘤血管生成的關(guān)系最密切，但其調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚［6］。已有結(jié)果提示，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)Id1可以募集骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞向腫瘤局部遷移，可誘導(dǎo)HUVECs的增殖、分化和血管生成。敲除Id1可完全抑制由血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)誘導(dǎo)的HUVECs的增殖、活化和血管生成，而在HUVECs中加入VEGF后，可誘導(dǎo)Id1的表達(dá)［7］。這些發(fā)現(xiàn)提示Id1在VEGF誘導(dǎo)HUVECs增殖、血管生成中起重要作用。也有文獻(xiàn)報道在前列腺癌中Id1通過激活VEGF的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)腫瘤的血管生成［8］。作為轉(zhuǎn)錄因子，Id1可以發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，能夠通過抑制血管生成抑制劑TSP-1的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)腫瘤的血管生成［9］。另外Id1能與其他促血管生成因子如αγβ3整合素、β5-整合素、bFGF、MMP-2以及Ephrin和TGF家族成員相互作用，從而發(fā)揮促腫瘤血管生成作用［10-11］。本研究的前期工作發(fā)現(xiàn)，COX-2通過對Id1的調(diào)控而參與了胃癌血管生成，并且Id1可以通過直接促進(jìn)VEGF的表達(dá)而放大這種促血管生成效應(yīng)［12］。綜上所述，Id1是一類新的促血管生成因子，可能通過調(diào)控下游分子的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)腫瘤血管生成。

惡性腫瘤的生物學(xué)特性之一是無限制生長，并在此基礎(chǔ)上發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，而基底膜是機(jī)體阻斷腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的天然組織屏障。腫瘤細(xì)胞自身或刺激宿主細(xì)胞分泌多種蛋白水解酶對基底膜和ECM的降解是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程中極其關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，其中MMPs起著決定性作用。而目前較多的研究已證實(shí)，MMPs在血管生成中的作用遠(yuǎn)較其降解ECM作用復(fù)雜且重要的多，所以MMPs也是一類促血管生成分子。多種MMPs通過降解ECM釋放促血管原性因子，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管狀形成［13］。MMP-2和 MMP-9是MMPs家族成員，在多種腫瘤中高表達(dá)，在促腫瘤血管生成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究提示MMP-2、MMP-9誘導(dǎo)腫瘤血管生成可能是其促癌機(jī)制之一。MMP-2-/-MMP-9-/-小鼠移植瘤的血管生成較野生型明顯減少［4］。在卵巢癌、胰腺癌中MMP-2、MMP-9在血管內(nèi)的表達(dá)增高［14］，在乳腺癌中MMP-9的高表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤的血管生成和生長加速［15］。

本實(shí)驗室的前期工作表明，Id1在胃癌組織中表達(dá)增高，并與胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為相關(guān)［16］，體內(nèi)實(shí)驗發(fā)現(xiàn)Id1參與了腫瘤的血管生成。另有報道提出，在Id1基因敲除的鼠胚胎纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中MMP-2的活性下降［4］。那么作為兩類重 要的促血管生成分子，Id1和MMP-2、MMP-9在胃癌血管生成中的關(guān)系如何，又是怎樣發(fā)揮作用的呢？

選取我院2016年1月—2018年1月收治的80例白血病PICC導(dǎo)管瘤患者作為研究對象。根據(jù)護(hù)理的不同可以分為實(shí)試驗組和常規(guī)組，每組患者40例。納入標(biāo)準(zhǔn)為：符合白血病臨床診斷，需靜脈化療，生命體征在正常范圍；排除標(biāo)準(zhǔn)：不愿參加本次實(shí)驗患者，合并腎肝肺等嚴(yán)重疾病患者，精神、心理疾病患者。實(shí)驗組中，男性患者26例，女性患者14例，年齡15～65歲，平均年齡（43.92±3.25）歲；常規(guī)組中，男性患者25例，女性患者15例，年齡為16～66歲，平均年齡（44.12±4.86）歲。兩組患者的一般資料對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

本研究表明，Id1和MMP-2、MMP-9在大多數(shù)胃癌組織中共表達(dá)，提示Id1和MMP-2、MMP-9均與胃癌的發(fā)生有關(guān)；利用小干擾RNA技術(shù)建立Id1低表達(dá)的SGC7901細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)在Id1低表達(dá)的胃癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的蛋白以及mRNA水平均下降，同時MMP-2、MMP-9的活性也下調(diào)，并且隨著Id1抑制效率的不同，MMP-2、MMP-9的表達(dá)及活性也不同。本研究檢測了SGC7901/Id1-siRNA細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9的蛋白含量，結(jié)果表明Id1-siRNA細(xì)胞可顯著抑制MMP-2、MMP-9的釋放，并且Id1的抑制效率越高，MMP-2、MMP-9的蛋白含量越低。以上體內(nèi)實(shí)驗結(jié)果提示：Id1對MMP-2、MMP-9有正性調(diào)控作用，MMP-2和MMP-9是Id1的下游分子。體外裸鼠成瘤實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)，Id1有促癌作用，Id1低表達(dá)的成瘤組織MMP-2、MMP-9的表達(dá)下調(diào)，同時對Id1的抑制越強(qiáng)，MMP-2、MMP-9的表達(dá)越低。針對Id1在胃癌生成作用中對MMPs的正向調(diào)節(jié)作用，抑制Id1同時也能夠抑制MMPs的表達(dá)，使得Id1成為新的有效的抗腫瘤血管生成的靶標(biāo)。

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