黃芩苷對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜的抑菌實(shí)驗(yàn)研究

張廣平

慢性牙周炎是由微生物感染引起的牙周組織的慢性炎癥性疾病，是成年人缺牙的主要原因。牙齦卟啉單胞菌(Pg)是慢性牙周炎最主要的致病菌之一［1］。黃芩苷抑菌抗炎的藥理作用，但是黃芩苷對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜的抑制作用尚少報(bào)道，本研究探討黃芩苷對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抑菌效果進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，為防止牙周炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)菌株為Pg ATCC33257;②主要試劑及儀器:100 mg/L黃芩苷。醫(yī)用聚氯乙烯(PVC)吸痰管，截成0.6 cm長(zhǎng)作為生物膜載體;戊二醛、無(wú)水氯化鈣、硝酸銀、對(duì)苯二酚、硫代硫酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。BHI培養(yǎng)基。

1.2 方法 ①體外生物膜模型建立:取培養(yǎng)的Pg用BHI培養(yǎng)基配制成1×105CFU/ml濃度菌液。24孔板每孔加入1 ml菌液和1mlBHI培養(yǎng)基，放入一經(jīng)高壓滅菌PVC片，37℃恒溫靜置培養(yǎng)5 d，每24 h更換1次培養(yǎng)液。光學(xué)顯微鏡4×10倍下觀察是否有細(xì)菌生物膜附著于PVC片，設(shè)置空白PVC片作為陰性對(duì)照;②黃芩苷對(duì) PgMIC測(cè)定:根據(jù)CLSI2009，先按2倍稀釋將黃芩苷100 μl加到96孔板中，再加入1 ×105CFU/mlPg 菌液 100 μl，37℃ 恒溫培養(yǎng) 24 h，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)孔內(nèi)所 含最低抗菌藥物濃度即為最低抑菌濃度(MIC);④黃芩苷對(duì)Pg生物膜的影響:將生長(zhǎng)有Pg的PVC片置人含黃芩苷的試管中，37℃下培養(yǎng)，各組分別于藥物作用0 h、6 h、12 h、24 h 后，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取出PVC 片，用連續(xù)稀釋法用BHI瓊脂平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果雙因素方差分析。P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察牙齦卟啉單胞菌生物膜 光學(xué)顯微鏡4×10倍下觀察，可見(jiàn)散落的白色絮狀膜樣物。細(xì)菌接種培養(yǎng)1 d后PVC片，無(wú)變化;培養(yǎng)3 d后PVC片，見(jiàn)散落的白色絮狀物;培養(yǎng)5 d后PVC片，見(jiàn)整個(gè)視野濃厚的絮狀膜樣物質(zhì)覆蓋，呈柵欄狀。

2.2 黃芩苷對(duì)Pg ATCC33257 MIC測(cè)定 黃芩苷對(duì)Pg ATCC33257的MIC為32.25 mg/L。

2.3 黃芩苷對(duì)生物膜的影響 結(jié)果顯示，黃芩苷組從6 h開(kāi)始活菌數(shù)開(kāi)始減少。見(jiàn)表1。

表1 經(jīng)黃芩苷作用后BF內(nèi)存活細(xì)菌數(shù)的變化(102CFU/ml)

3 討論

生物膜(Biofilm)是指細(xì)菌不可逆轉(zhuǎn)地黏附在物體表面或其本身細(xì)胞之間相互黏附，并被其自身所分泌的細(xì)胞外黏質(zhì)所包裹而形成的特殊結(jié)構(gòu)，它的形成導(dǎo)致細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和基因表達(dá)的改變。在由細(xì)菌引起的慢性感染性疾病中，如牙周病，生物膜作為致病因子起著重要作用。由于生物膜的存在，使得膜內(nèi)的細(xì)菌逃逸宿主免疫系統(tǒng)和抗生素的殺傷作用，導(dǎo)致了廣泛的耐藥性，成為潛在的感染源。

本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)菌極易黏附的PVC吸痰管作為載體進(jìn)行牙齦卟啉單胞菌生物膜的體外培養(yǎng)。結(jié)果顯示，培養(yǎng)3 d后PVC片，見(jiàn)散落的白色絮狀物;培養(yǎng)5 d后PVC片，白色絮狀物質(zhì)層次多，較致密。研究結(jié)果提示5 d后牙齦卟啉單胞菌在體外可形成成熟的生物膜。

黃芩苷具有清熱解毒、抑菌抗炎、鰲合金屬離子和抗腫瘤等藥理作用。有研究表明黃芩苷對(duì)減輕牙周炎動(dòng)物模型的牙周炎癥反應(yīng)，還能抑制牙周膜細(xì)胞對(duì)細(xì)菌脂多糖的炎性反應(yīng)［2］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，32.25 mg/L的黃芩苷對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜有明顯的抑制和破壞，提示其對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜的發(fā)育有明顯的破壞作用，且作用與劑量呈正比。黃芩苷對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜的抑制作用可能是其抑制細(xì)菌黏附性的機(jī)制之一。我們的研究結(jié)果提示黃芩有可能為牙周炎的綜合治療提供一條新途徑。

［1］鄧輝，吳亞菲.牙齦卟啉單胞菌與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的關(guān)系.國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，36(4):438-440.

［2］黃綺凌，宋寧.黃芩對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎血清IgG1和IgG2a水平影響的研究.中國(guó)病理生理雜志，2011，27(1):171-174.