國內(nèi)5種豬圓環(huán)病毒PCV2抗體檢測試劑盒的比較試驗

吳華偉，高金源，鄧 永，范 鵑，郎洪武，陳曉春

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.揚州優(yōu)邦生物制藥有限公司，江蘇揚州 225008)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)，屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬的成員，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。自20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)該病毒以來，PCV2病毒在世界各國迅速蔓延。我國于2000年檢測到了該病毒的存在［1］。PCV2抗體檢測對于進(jìn)行PCV2流行病學(xué)調(diào)查、疫苗效果評價及試驗用陰性豬的篩選等具有重要意義。目前，PCV2抗體檢測的常用方法有病毒中和試驗(SN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗法(IPMA)。鑒于SN方法費時耗力，且PCV2病毒在細(xì)胞上很難出現(xiàn)細(xì)胞病變，常需借助免疫熒光試驗(FA或IFA)進(jìn)行結(jié)果判定。因此常用ELISA或IPMA方法進(jìn)行PCV2抗體檢測。國內(nèi)已有商品化的豬圓環(huán)病毒PCV2抗體檢測試劑盒出售［2－3］。為了解目前國內(nèi)PCV2滅活疫苗效力檢驗用PCV2抗體檢測試劑盒的質(zhì)量，本試驗選取國內(nèi)5個廠家生產(chǎn)的5種PCV2抗體檢測試劑盒(其中4種為ELISA方法，1種為IP-MA方法)，分別對其進(jìn)行敏感性、特異性和符合率測定，為實際應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑盒 豬圓環(huán)病毒PCVII型抗體檢測試劑盒(荷蘭CEDI)，批號為170408;豬圓環(huán)病毒PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒(A企業(yè))，批號為081103;豬圓環(huán)病毒PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒(B企業(yè))，批號為100805;豬圓環(huán)病毒PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒(C企業(yè))，批號為100807;豬圓環(huán)病毒PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒(D企業(yè))，批號為20101101;豬圓環(huán)病毒PCV2抗體IPMA檢測試劑盒(E企業(yè))，批號為20100417。

1.2 檢測試劑和血清 檢測PCV2抗體用間接免疫熒光檢測板(96孔/塊)、PK15細(xì)胞空白對照板(96孔/塊)均由本實驗室制備;FITC標(biāo)記的羊抗豬IgG為Sigma公司產(chǎn)品;PCV2陽性血清和陰性血清樣本，由本實驗室鑒定和保存。

1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱(SANYO);微量移液器(effendorf);酶標(biāo)儀(Thermo/1500型);熒光顯微鏡(OLYMPUS/IX71型)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清的確定 對本試驗室保存的PCV2血清樣品，先采用荷蘭CEDI公司生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒PCVII型抗體檢測試劑盒進(jìn)行初篩，然后按文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行間接免疫熒光試驗，以兩種方法檢測結(jié)果均一致的血清樣品作為標(biāo)準(zhǔn)血清樣品。

2.2 試劑盒敏感性、特異性和符合率測定 按各廠家提供的試劑盒使用說明書的操作方法，分別對標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行檢測，參照農(nóng)業(yè)部第683號公告有關(guān)規(guī)定，評價國內(nèi)各試劑盒的敏感性、特異性和符合率。其計算公式如下:敏感性=(與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陽性血清總份數(shù))×100%;特異性=(與標(biāo)準(zhǔn)陰性血清檢測結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陰性血清總份數(shù))×100%;符合率=(與標(biāo)準(zhǔn)血清檢測結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)血清總份數(shù))×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 5個企業(yè)的PCV2試劑盒的敏感性、特異性和符合率測定結(jié)果 按以上方法共篩選出57份標(biāo)準(zhǔn)血清樣品，其中標(biāo)準(zhǔn)陽性血清26份，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清31份。分別用5個企業(yè)生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒檢測57份標(biāo)準(zhǔn)血清，結(jié)果如表1所示。從敏感性測定結(jié)果看，企業(yè)A和企業(yè)E生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒敏感性均達(dá)到100%(26/26)，而其他3個企業(yè)的PCV2抗體檢測試劑盒敏感性僅在57.7% ～76.9%;從特異性測定結(jié)果看，5個企業(yè)的試劑盒特異性基本保持在90%左右(87.1% ～93.5%);從符合率看，除企業(yè)C和企業(yè)D的PCV2抗體檢測試劑盒符合率較低，為75.4%，其余3個企業(yè)的PCV2抗體檢測試劑盒符合率在86%以上。表明國內(nèi)生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒特異性相對較好，但不同廠家敏感性差異較大。

表1 5個企業(yè)生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒檢測57份標(biāo)準(zhǔn)血清結(jié)果

3.2 5個企業(yè)試劑盒間檢測結(jié)果的符合率測定從表2可以看出，5個企業(yè)試劑盒檢測與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清檢測結(jié)果完全一致的血清份數(shù)為36份(其中標(biāo)準(zhǔn)陽性血清19份，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清17份)，總體符合率為63.2%(36/57)。說明國內(nèi)各企業(yè)生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒之間檢測結(jié)果的符合性較差，需要進(jìn)一步改進(jìn)。

表2 5個企業(yè)試劑盒間檢測結(jié)果的一致性

4 討論

盡管攻毒試驗是評價PCV2滅活疫苗效力的最可靠方法，但因其操作繁瑣，且需要嚴(yán)格的生物安全措施，因此常采用PCV2抗體檢測作為PCV2滅活疫苗效力評價的替代方法。國內(nèi)企業(yè)已申報的PCV2滅活疫苗，如PCV2滅活疫苗(SH株)和PCV2滅活疫苗(DBN－SX07株)均采用ELISA方法進(jìn)行免疫動物抗體水平檢測，而PCV2滅活疫苗(LG株)則采用IPMA方法進(jìn)行免疫動物抗體水平檢測。然而，實際應(yīng)用中，大多數(shù)疫苗生產(chǎn)企業(yè)在進(jìn)行疫苗效力評價時所用的試劑盒均為自行制備的或購買的未獲國家批準(zhǔn)的產(chǎn)品，缺少必要的質(zhì)量驗證和監(jiān)管措施，存在一定的質(zhì)量隱患。從本試驗選取的5個企業(yè)生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒(其中企業(yè)A已獲農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，其余4種均未獲準(zhǔn)正式生產(chǎn))的檢測結(jié)果看，企業(yè)A的ELISA試劑盒和企業(yè)E生產(chǎn)的PCV2－IPMA法檢測試劑盒敏感性和特異性相對較好，可以作為PCV2抗體監(jiān)測和疫苗效力評價的首選，其余3個企業(yè)的PCV2抗體檢測試劑盒敏感性較差，不太適合作為評價PCV2滅活疫苗免疫動物后產(chǎn)生抗體的檢測手段，且各試劑盒間檢測結(jié)果的一致性較差。因此，在新獸用生物制品申報時，對采用未經(jīng)正式批準(zhǔn)的試劑或試劑盒進(jìn)行制品質(zhì)量的評價(特別是在有可能影響制品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如試驗豬篩選、效力檢驗等)是否可行，以及如何加強(qiáng)對這些試劑或試劑盒的驗證或管理，亟待有關(guān)部門深入研究，盡快出臺有關(guān)規(guī)定。總體上看，國內(nèi)的PCV2抗體檢測試劑盒種類繁多，質(zhì)量參差不齊。科研單位需進(jìn)一步加大科研力度，獸醫(yī)行政部門需進(jìn)一步加強(qiáng)試劑盒技術(shù)規(guī)范，完善質(zhì)量驗證的相關(guān)程序和制度，同時加強(qiáng)試劑盒監(jiān)督檢驗力度，確保PCV2試劑盒敏感、特異、質(zhì)量可控，更好地服務(wù)于PCV2疫病監(jiān)測和防控工作。

［1］郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測［J］.中國獸醫(yī)科技，2000，30(3):325.

［2］農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第742號［Z］.

［3］農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1220號［Z］.

［4］Allan G M，Ellis J A.Porcine Circoviruses:a Review［J］.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2000，12(1):3 －14.