四君子湯提取工藝優化研究

張挪威，萬長榮，趙 宏，閆秋會，朱曉宇，徐霄龍，許劍琴

(1.中國農業大學動物醫學院，北京 100193;2.北京農學院動物科技系，北京 102206;3.農業部獸用化藥和中草藥創制與評價重點開放實驗室，北京 100193)

四君子湯源于宋代《太平惠民和劑局方》，由黨參(原方為人參)、白術、茯苓(去皮)、甘草(炙)四味基本中草藥組成，主治脾胃氣虛［1］。研究結果證實四君子湯具有誘導裸小鼠移植性人胃癌細胞凋亡和抑制胃癌細胞生長的作用［2－3］，可以通過調節小腸細胞因子的表達改善利血平誘導的脾虛大鼠黏膜免疫功能［4］和脾虛狀態下對藥物的吸收［5］。四君子湯總多糖和四君子湯去蛋白多糖可改善環磷酰胺誘導的免疫功能抑制、促進腸道黏膜免疫功能恢復［6］，在促進胃腸黏膜損傷修復方面也有一定的作用。目前關于四君子湯最優水提工藝的研究還缺少詳細報道。為建立科學合理的提取工藝，進一步推動四君子湯的臨床應用開發，本研究根據處方中藥材有效成分的理化性質和藥理作用，以四君子湯中主要藥效成分之一甘草酸的提取量為考察指標，采用L9(34)正交試驗對藥物浸泡時間、加水量、煎煮時間和煎煮次數加以考察，對四君子湯的水提工藝進行了優化研究。

1 材料和方法

1.1 實驗器材

1.1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.1.2 試劑 甘草酸單銨鹽標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號110731－200615);黨參、白術、茯苓和甘草(炙)購于北京同仁堂藥店，經鑒定為《中國藥典》收載品種;甲醇、醋酸銨、冰醋酸為色譜純試劑，其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 正交實驗設計

1.2.1.1 因素水平的選擇 本處方選取浸泡時間、加水量、煎煮時間及煎煮次數作為考察因素，各因素取3個水平(表1)，按照L9(34)正交試驗設計篩選最佳工藝條件。

表1 正交實驗設計篩選四君子湯煎煮工藝

1.2.1.2 正交試驗樣品制備 黨參、白術、茯苓和甘草按照2∶2∶2∶1的質量比稱取后混合，按照表2正交試驗設計方案水煎提取，提取液混合后真空抽濾和放冷，置200 mL量瓶中備用。

1.2.2 甘草酸單銨鹽的測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜條件與系統適用性試驗:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，檢測器Serial No:DE64262691，甲醇－1% 醋酸銨溶液－冰醋酸(64∶36∶1)為流動相，檢測波長為250 nm，檢測理論板數不低于3000。

1.2.2.2 標準品溶液的制備 精密稱取甘草酸單銨鹽標準品適量，用流動相制成每1 mL分別含0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg 甘草酸單銨鹽溶液，0.22 μm孔徑過濾，即得。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取各步正交試驗所煎煮的四君子湯5 mL，加入等體積的雙蒸水稀釋，搖勻，0.22 μm 孔徑濾過，即得。

1.2.2.4 標準曲線的制備 分別精密吸取不同濃度的甘草酸單銨鹽標準品溶液進行測定，標準品溶液進樣量為 10 μL，流動相流速 1 mL/min，柱溫25℃，檢測時間13 min，檢測信號波長250 nm。按1.2.2.1項下色譜條件分別注入液相色譜儀，測定其峰面積，以進樣樣品對應甘草酸單銨鹽質量為橫坐標(X)，以甘草酸單銨鹽峰面積為縱坐標(Y)，得線性回歸方程Y=9.38+699.66X，相關系數R=1。

1.2.2.5 精密度實驗 精密吸取甘草酸單銨鹽標準品溶液 10 μL(濃度為 0.1959 mg/mL)，按1.2.2.1項下色譜條件連續進樣5次，測定峰面積。RSD=0.47%，表明儀器精密度良好。

1.2.2.6 穩定性實驗 將同一甘草酸單銨鹽標準品溶液分別于 0、3、6、10 h 進樣 10 μL，測定峰面積。RSD=1.17%，表明標準品溶液穩定性良好。

1.2.2.7 重復性試驗 取同一批四君子湯煎劑5份，按 1.2.2.3 項中的方法制備供試品溶液，按1.2.2.1項中的色譜條件進行HPLC分析，計算甘草酸單銨鹽提取量。RSD=1.69%，表明重復性良好。1.2.2.8 實驗樣品和陰性對照品的測定 分別精密吸取甘草酸單銨鹽標準品溶液、供試品溶液各10 μL注入色譜儀測定，并根據1.2.2.4項中的標準曲線線性回歸方程求甘草酸單銨鹽提取量，結果如表2所示。

1.2.3 驗證實驗 按基本處方稱取黨參等藥材3批，對上述正交試驗所得提取工藝條件進行驗證，即按第2水平制備四君子湯煎劑3批，測定煎劑中甘草酸單銨鹽提取量。結果表明，最佳煎煮條件可靠，方法可重復操作。

2 結果及分析

2.1 實驗結果 取9份正交設計實驗樣品分別測定甘草酸單銨鹽提取量。在實驗色譜條件下，標準品溶液中甘草酸單銨鹽出峰時間在7.25 min左右，與樣品(圖1)能達到基線分離，沒有干擾。各正交水平實驗中四君子湯甘草酸單銨鹽提取結果如表2、表3和圖1所示。驗證試驗結果如表4所示。

表2 正交實驗結果

圖1 甘草酸單銨鹽高效液相色譜圖

2.2 結果分析 采用SPSS 12.0統計軟件對結果進行數據處理，綜合直觀分析和方差分析判斷各因素對提取效果的影響程度，篩選出在該試驗條件下的優化提取參數(表3)。根據正交實驗結果可知(表4)，以甘草酸單銨鹽為評價指標，各因素的影響順序為煎煮次數＞煎煮時間＞用水劑量＞浸泡時間，其中煎煮次數對工藝有顯著影響，其他3個因素均無顯著影響，因此煎煮次數為3。而對于無顯著影響的因素，只需結合具體工作及生產實際要求，本著盡量選擇平均數最大的水平，最終確定為煎煮時間2 h，加10倍水，浸泡30 min。

表3 正交實驗結果分析表

表4 正交實驗結果計算表

3 討論

提取工藝對藥品的安全性和有效性有著重要影響，工藝優化評價標準一般應以有效成分和已知成分為主要指標［7］。對四君子湯研究有人以提取物中人參皂苷Rg1的含量為評價指標［8］，也有以四君子湯中其他活性成分如人參總皂甙和總多糖為指標［9］。《中國藥典》把甘草酸的量作為評價甘草藥材及其制品質量的重要指標，通常要求不低于2%［12］，現有研究已發現了160多種甘草黃酮類化合物［10］，其中有60多種含有三萜類化合物以及香豆素類、氨基酸、雌性激素、有機酸等多種成分［11］。甘草酸(亦稱甘草甜素，Glycyrrhizin)是甘草中最重要的三萜類化合物，含量可達 3.63% ～13.06%［13］，亦為其主要活性成分，本實驗選擇甘草的穩定成分之一甘草酸單銨鹽作為測定指標。有人研究煎煮時間對四君子湯某些成分的影響，指出隨著煎煮時間的延長，煎膏煎出率、總黃酮化合物及甘草酸在水煎液中的含量均有變化，煎煮時間由10～30 min時均呈上升趨勢，40 min及其后則呈平緩下降［14］。結合前人對四君子湯提取工藝的研究，確定選擇浸泡時間、加水量、煎煮時間和煎煮次數4個影響因素，并從3個水平上分別討論這4個因素的作用。在對提取方法、純化方法進行選擇、優化的過程中，本著可行、實用的原則，以具體實驗結果為基礎，綜合統計分析及直觀分析得出結論，最終確定四君子湯最優煎煮條件為:浸泡30 min，加水量10倍、煎煮時間2 h，煎煮次數為3。

致謝:本研究由教育部高等學校博士學科點專項科研基金(No.201003060－9/10)支持，感謝CAU－BUA中獸醫藥學科研教學團隊成員提供的無私幫助。

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