前列腺癌與前列腺增生組織中P21活化激酶6的表達(dá)及意義

王新敏 章 樂(lè) 王勤章 丁國(guó)富 (石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 石河子 832000)

目前認(rèn)為雄激素在前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)的發(fā)病中起重要作用，而雄激素受體是雄激素發(fā)揮作用的中心環(huán)節(jié)〔1〕。P21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)是通過(guò)酵母雙雜交識(shí)別出來(lái)的雄激素受體關(guān)聯(lián)蛋白〔2〕，可參與雄激素受體的旁路調(diào)節(jié)。PAK6可與雄激素受體的配體結(jié)合域結(jié)合，是惟一已知的能與雄激素受體相互作用的PAK家族成員。但PAK6在PCa中的作用機(jī)制尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法和RT-PCR方法檢測(cè)PCa和前列腺增生的組織中PAK6基因、蛋白表達(dá)情況，以探討其與PCa發(fā)生和病理分級(jí)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 石蠟組織標(biāo)本:收集新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科1998～2008年P(guān)Ca組織標(biāo)本(n=70)及前列腺增生組織標(biāo)本(n=20)。標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定12～24 h后，常規(guī)石蠟包埋存檔。其中高分化11例，中分化19例，低分化40例。新鮮標(biāo)本:收集新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2007～2008年P(guān)Ca新鮮組織標(biāo)本(n=10)及前列腺增生新鮮組織標(biāo)本(n=10)，液氮保存。切片均經(jīng)兩位資深病理醫(yī)生復(fù)查確診。

1.2 主要試劑 PAK6多克隆抗體(IMGENGX公司，美國(guó));Trizol(Invitrogen公司，美國(guó));RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas公司);PrimeSTARTM HS DNA多聚酶(TaKaRa公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)

1.3.1 SP法 石蠟包埋組織后4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，PBS沖洗。高溫修復(fù)抗原，冷卻至室溫，PBS沖洗2×3 min，滴加一抗，4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗3×5 min，滴加生物素標(biāo)記的二抗。室溫下孵育10 min，PBS沖洗3×3 min，聯(lián)苯二胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2 結(jié)果判斷 以半定量積分法〔3〕判斷每張切片PAK6的表達(dá)結(jié)果，以陽(yáng)性細(xì)胞比例與顯色強(qiáng)度計(jì)分。(1)染色強(qiáng)度:分為0～3級(jí)，陰性為0，無(wú)淡黃色及棕黃色顆粒，或陽(yáng)性顆粒＜10%;弱陽(yáng)性為1，淡黃或棕黃色顆粒占10% ～30%;中等強(qiáng)度為2，淡黃或棕黃色顆粒占30% ～60%;強(qiáng)陽(yáng)性為3，淡黃或棕黃色顆粒＞60%。(2)陽(yáng)性細(xì)胞比例:＜30%為1分，30% ～65%為2分，＞65%為3分。(1)+(2)兩者相加為積分，用陽(yáng)性系數(shù)大小表示蛋白質(zhì)表達(dá)的高低:積分0～1者為陰性，2分為弱陽(yáng)性，3～4分為陽(yáng)性，＞4分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4 PAK6 mRNA表達(dá)

1.4.1 引物序列 所有引物由TaKaRa公司合成。β-actin(695 bp):5'-caccacaccttctacaatgagc-3';5'-gtgatctccttctgcatcctgt-3'。PAK6(315 bp):5'-caggtctttgtatgccactgag-3';5'-ggaggtctgctttcggtagag-3'。

1.4.2 RT-PCR 檢測(cè)PAK6 mRNA表達(dá)取50 mg組織放入1.5 ml EP管中，加入1 ml Trizol，做組織勻漿，提取出總RNA，取2μl RNA樣品，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳以觀察所提RNA質(zhì)量;取2μl RNA稀釋至100μl，用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD260、OD280值，以測(cè)定RNA純度和濃度。貯存于-70℃?zhèn)溆谩Ｒ远康目俁NA為模板，按RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;以合成的cDNA為模板，利用前述引物，分別對(duì)β-actin與PAK6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min后，進(jìn)行 30輪循環(huán)(94℃ 45 s，56℃ 35 s，72℃ 30 s)，最后72℃延伸5 min。然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.3 半定量結(jié)果分析 通過(guò)凝膠成像密度掃描系統(tǒng)測(cè)定各擴(kuò)增條帶的光密度積分值。結(jié)果采用Quatity One軟件分析，以PAK6擴(kuò)增條帶的光密度積分與對(duì)應(yīng)β-actin擴(kuò)增條帶的光密度積分之比值表示，并以此相對(duì)光密度積分值作為半定量指標(biāo)，反映PAK6基因的相對(duì)mRNA水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以確保結(jié)果的可靠性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析;計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，One-Way ANOVA方法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 PAK6在前列腺增生和PCa組織中的表達(dá) 20例前列腺增生的標(biāo)本中 PAK6陽(yáng)性率為70%(6/14)。70例 PCa中PAK6陽(yáng)性率為 95.7%(3/67)，組間比較差異顯著(χ2=11.429，P=0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 PAK6在不同分化程度前列腺癌組織中的表達(dá) 高分化PCa組織由癌體排列、彼此分離的腺體構(gòu)成，腺體中等大小，基本相似;中分化PCa組織分化中等，腺體大小不一，形態(tài)不規(guī)則;低分化PCa，腺腔結(jié)構(gòu)基本消失，上皮細(xì)胞排列成實(shí)性片狀、條索狀;由高分化至低分化Pca，其PAK6染色強(qiáng)度逐漸增加。70例高、中、低分化PCa的PAK6表達(dá)陽(yáng)性率逐漸升高，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，PCa的分化情況與PAK6的表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.502，P＜0.01。見(jiàn)圖1，表2。

2.3 RT-PCR結(jié)果 PAK6和β-actin在前列腺增生和PCa組織中均得到表達(dá)片段，分別為315 bp和695 bp。β-actin的條帶表達(dá)較為均一，但PCa組織中的PAK6條帶明顯亮于前列腺增生組織。見(jiàn)圖2。半定量結(jié)果分析表明，前列腺增生組織的PAK6/β-actinmRNA光密度之比為0.21±0.06，PCa組織的PAK6/β-actinmRNA光密度之比為0.74±0.07，兩者有顯著性差異(P＜0.01)。

表1 PAK6在前列腺增生和PCa組織中的表達(dá)(n)

表2 PAK6在不同分化程度PCa組織中的表達(dá)(n)

圖1 PAK6在不同分化程度PCa組織中的表達(dá)(×400)

圖2 RT-PCR檢測(cè)PAK6基因在前列腺增生和前列腺癌組織中的表達(dá)

3 討論

PAK是一類進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶〔4〕。作為小G蛋白R(shí)ho家族的下游靶蛋白，可被生長(zhǎng)因子及其他胞外信號(hào)活化。PAK包括2個(gè)亞家族(PAKⅠ和PAKⅡ)，6個(gè)家族成員(PAK1～6)〔5〕。PAK1～PAK5參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、細(xì)胞生存、有絲分裂和血管生成等生物學(xué)功能，在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用〔6〕。Ⅱ類PAK家族中的PAK6在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用〔7〕。PCa生物學(xué)特性非常復(fù)雜，目前對(duì)其演變過(guò)程及預(yù)后尚缺乏深入的了解。但可以肯定的是，雄激素及其受體與前列腺的發(fā)育和PCa的發(fā)生有密切關(guān)系〔8〕。而PAK6研究表明，PAK6能夠與雌激素受體及雄激素受體相互作用并抑制雌激素受體及雄激素受體的轉(zhuǎn)錄激活作用。

PAK6作為惟一可與雄激素受體作用的PAK蛋白，在PCa中的作用機(jī)制尚未完全明了。PAK6可與雄激素受體的配體結(jié)合域上的氨基酸序列結(jié)合，更為重要的是激活的PAK6能抑制已受刺激的雄激素受體的核轉(zhuǎn)位〔9〕。PAK6結(jié)合雄激素受體并與之共定位于細(xì)胞核內(nèi)，抑制雄激素受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄〔10〕。這種抑制不是雄激素受體表達(dá)減少的結(jié)果，也不是PAK6對(duì)雄激素受體磷酸化減弱的結(jié)果，相反顯示的是PAK6結(jié)合到雄激素受體上阻止雄激素受體結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑的結(jié)果。PAK6與核受體的相互作用表明核激素受體與小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑有交互作用，推測(cè)PAK6可能參與PCa和乳腺癌等與激素相關(guān)的腫瘤的生物學(xué)行為。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)70例PCa和20例前列腺增生標(biāo)本的PAK6表達(dá)，發(fā)現(xiàn)前列腺增生和PCa中PAK6均可以表達(dá)，但陽(yáng)性表達(dá)率分別為70%和95.7%。由于石蠟組織的RNA保存不完好，提取較為困難，恐有漏檢情況出現(xiàn)，因此，本研究收集了2007～2008年的新鮮組織樣本，對(duì)其進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)PAK6 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果與免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致。提示無(wú)論是在mRNA水平還是在蛋白水平上，PAK6在前列腺增生和PCa新鮮組織中均有表達(dá)，但表達(dá)程度不一樣，PCa的表達(dá)水平明顯高于前列腺增生組織，兩者有顯著性差異。免疫組織化學(xué)檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)，在不同分化程度的PCa組織中PAK6表達(dá)與PCa的分化等級(jí)明顯呈正相關(guān)性，PAK6陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)程度隨著惡性度的增高明顯增加。這可能與PAK6與雄激素受體之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。可能正是由于低分化PCa組織的雄激素表達(dá)大量增加，使PAK6分泌量增加，力圖抑制已受刺激的雄激素受體進(jìn)行核轉(zhuǎn)位。增多的PAK6結(jié)合雄激素受體并與之共定位于細(xì)胞核內(nèi)，抑制雄激素與雄激素受體結(jié)合介導(dǎo)的下游信號(hào)的傳遞。所以在低分化PCa細(xì)胞中，PAK6陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，提示PAK6表達(dá)增強(qiáng)與PCa細(xì)胞惡性程度有關(guān)。因新鮮組織的PCa樣本數(shù)較少，今后還應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)做更深入的研究。

本研究結(jié)果初步表明，PAK6可能參與了PCa與激素相關(guān)的腫瘤的生物學(xué)行為，并有助于明確PAK6在PCa發(fā)生發(fā)展中的作用，提示臨床上若要全面阻斷雄激素作用，除要阻斷雄激素受體的信號(hào)外，還需抑制其旁路蛋白的激酶活性，為臨床研究、診斷、治療PCa提供新的思路。

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