全腦缺血再灌注大鼠小腦 EGF的動態表達

趙 欣 吳 杰 李愛麗 (吉林大學第二醫院神經內科，吉林 長春 130041)

表皮生長因子 (EGF)是一種神經營養因子，對中樞神經系統具有一定營養、保護作用。然而，在腦缺血再灌注損傷過程中，EGF對小腦的動態保護作用如何，目前國內、外尚無此類報道。本研究選用老齡大鼠制作全腦缺血再灌注模型，應用免疫組化技術研究全腦缺血再灌注大鼠小腦 EGF的含量變化，探討腦缺血再灌注損傷過程中EGF對小腦的動態保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用Wistar老齡大鼠30只，雌性16只，雄性14只，體重420～520 g，月齡10個月以上。雌雄分開飼養并隨機分組，假手術組5只;腦缺血15 min再灌注1 h和6 h、2 d、4 d、9 d 5 組，每組5只。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用改良Pulsinelli-Brierley血管阻塞法，用10%水合氯醛給大鼠進行腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)，分離雙側頸總動脈，用兩根縫合線分別繞過兩側頸總動脈系一松套(待次日拉套斷流用)，電凝雙側椎動脈24 h后在大鼠清醒狀態下拉雙側頸總動脈套，阻斷雙側頸總動脈血流15 min，此為腦缺血期，去除頸總動脈套為再灌注期。假手術組不做椎動脈電凝、頸總動脈斷流，其余過程同實驗組。

1.2.2 試劑與儀器 各組大鼠在完成實驗過程后給予10%水合氯醛過量腹腔麻醉，暴露心臟，剪開右心耳，在左心室插管，先用200 ml生理鹽水灌沖，然后用4%多聚甲醛固定腦組織，取腦分離出小腦，浸腦組織于相同固定液中48 h，石蠟包埋，免疫組化染色采用ABC法。試劑盒由北京中山生物技術有限公司提供。

1.2.3 測定指標 神經元、間質細胞中出現棕黃色或棕褐色顆粒判斷為陽性細胞。

1.3 統計學分析 采用SPSS10.0軟件，計量資料以±s組間比較采用t檢驗。

2 結果

在對照組，小腦分子層、梨狀細胞層、顆粒細胞層和髓質均可見少量EGF免疫陽性細胞表達，棕褐色顆粒存在于細胞膜、細胞質或細胞核中。

在小腦分子層，缺血再灌注1～6 h時EGF表達與對照組沒有明顯差異(P＞0.05);再灌注2 d，其表達明顯增加(P＜0.05)，但再灌注4～9 d時EGF表達恢復至對照組水平(P＞0.05)。在小腦梨狀細胞層，缺血再灌注1～6 h時EGF表達與對照組無明顯差異(P＞0.05);再灌注2 d，EGF表達呈一過性增高(P＜0.05)，此后降至正常水平。在小腦顆粒細胞層，于缺血再灌注1～6 h時EGF表達與對照組沒有明顯差異(P＞0.05);再灌注2～4 d，其表達持續增加。隨著再灌注時間的延長，9 d時，EGF表達恢復至對照組水平(P＞0.05)。在小腦髓質，缺血再灌注1 h時EGF表達與對照組沒有明顯差異(P＞0.05);再灌注6 h～9 d，其表達持續減少，低于對照組水平(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠缺血再灌注不同時間小腦EGF的表達(±s)

表1 大鼠缺血再灌注不同時間小腦EGF的表達(±s)

與假手術組比較:1)P＜0.05;不同時間點各實驗組比較:2)P＜0.05

7.02±2.10 6.30±2.02 5.21±0.63 10.67±1.15再灌注1 h 5 7.05±1.36 8.32±0.81 6.02±0.62 9.36±2.01再灌注6 h 5 8.49±1.69 8.96±1.18 7.35±1.12 6.37±1.381)再灌注2 d 5 13.66±1.81)2) 10.90±1.221) 9.09±1.061) 6.55±1.521)再灌注4 d 5 9.30±1.982) 7.63±1.012) 9.98±1.581) 6.33±1.631)再灌注9 d 5 6.30±0.982) 6.80±1.35 6.66±1.192) 5.36±1.181)分子層 梨狀細胞層 顆粒細胞層 髓質對照組組別 n 5

3 討論

3.1 EGF的生物學特性及其作用機制 EGF是1962年由Cohen從雄鼠頜下腺中分離提取的一種可刺激神經生長的活性物質，主要由頜下腺腺管細胞分泌。EGF也見于生理狀態下的幾乎所有體液中，如唾液、血液、尿液、胃液、羊水、組織液等。盡管外周血EGF含量極少，但血小板顆粒內的EGF濃度卻很高。成熟的EGF是具有53個氨基酸殘基的單鏈多肽，分子量6 045 Da。EGF受體廣泛分布于哺乳動物的上皮細胞，EGF與靶細胞表面的受體結合，通常具有高親和性、可飽和性、特異性等特征。EGF的生物學活性可分兩類:①遲發效應:促進營養細胞的DNA合成，激活鳥氨酸脫羧酶，引起腐胺的積累，提高γ-谷氨酸轉肽酶的基礎水平，增加角蛋白、纖維蛋白和膠原蛋白的合成，促進骨形成等。②短期效應:發生在攝入EGF的數秒鐘到數分鐘內，包括促進或抑制離子、分子的轉運，影響磷酸鹽的代謝等。EGF與其受體結合后能促進創傷愈合，已被用于角膜、胃、腸道、肝臟、骨骼、神經等多種組織創傷的研究。EGF對神經系統發育、營養均有重要作用，其作用機制尚有待于進一步研究。有學者認為可能與一種神經介質合成酶的酪氨酸羥化酶的水平變化有關。生理狀態下，1 ng/ml的EGF就能顯著提高中樞神經系統神經元的存活力和軸索的再生能力，當EGF達到10 ng/ml時作用達到頂點。EGF對帕金森病患者黑質紋狀體多巴胺神經元具有保護作用〔1〕，對外周神經也具有神經營養作用，因為阻斷EGF的信息傳遞途徑能明顯影響神經軸突的生長〔2〕。

3.2 EGF的表達及意義 本研究結果顯示，小腦缺血再灌注1 h其各層結構EGF的表達均無明顯增加;于缺血再灌注6 h小腦分子層、顆粒細胞層和梨狀細胞層其表達也無明顯增加，這表明小腦分子層、顆粒細胞層和梨狀細胞層均不具有快速敏捷的EGF保護作用，這就提示臨床醫生在缺血性腦血管疾病早期應盡早給予神經營養劑治療，以保護受損的腦組織。再灌注2 d，除小腦髓質外其他三層結構EGF表達均增加，說明小腦大部分組織具有遲發性EGF的保護作用。筆者以往關于海馬與EGF的研究中，缺血再灌注6 h海馬內EGF表達即開始增加，故小腦與海馬相比前者EGF的保護作用具有滯后性。再灌注4～9 d，小腦分子層和梨狀細胞層EGF表達均回降至基礎水平，表明小腦分子層和梨狀細胞層EGF的保護作用較為短暫。而小腦顆粒細胞層于再灌注4 d EGF表達仍在增加，再灌注9 d時EGF表達降至對照組水平，說明小腦顆粒細胞層EGF的神經元保護作用強于小腦其他各層，故小腦顆粒細胞層具有較為持久的EGF保護作用。EGF是通過一氧化氮酶抑制細胞凋亡而對小腦顆粒細胞產生保護作用〔3〕。小腦髓質于再灌注6 h～9 d期間，EGF的表達一直處在低于假手術組水平，這表明小腦髓質缺乏EGF的保護作用，提示臨床小腦髓質可能更易受到缺血損害，應注意保護。

1 Hanke M，Farkas LM，Jakob M，et al.Heparin-binding epidermal growth factor like growth factor:a component in chromaffin granuleswhich promotes the survival of nigrostriatal dopaminergic neurones invitro and in vivo〔J〕.Neuroscience，2004;124(4):757-66.

2 Hermann PM，Nicol JJ，Nagle GT，et al.Epidermal growth factor-dependent enhancement of axonal regeneration in the pond snail Lymnaea stagnalis:role of phagocyte survival〔J〕.J Comp Neurol，2005;492(4):383-400.

3 戴 德，鐘艷秋.表皮生長因子抑制小腦顆粒細胞凋亡的作用〔J〕.寧夏醫學雜志，2006;28(5):357-9.