缺血后處理對大鼠骨骼肌缺血再灌注腎損傷ICAM-1表達的影響及其意義

張彥榮 高 翔 蔡建輝 (河北醫科大學第二醫院，河北 石家莊 050000)

缺血-再灌注損傷(IRI)不僅損傷肢體局部組織，而且可影響遠隔的內臟器官，引起多器官功能衰竭，危及生命〔1〕。下肢缺血再灌注引起的急性腎損傷是臨床上常見且嚴重的并發癥，發生機制復雜。有研究顯示，骨骼肌IRI早期，氧自由基、炎性因子的作用是導致遠隔腎損傷的主要原因。本實驗通過對大鼠后肢肌肉IRI后腎損傷進行研究，觀察細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達變化，初步探討骨骼肌IRI致遠隔腎損傷的部分機制及缺血后處理的保護效果。

1 材料與方法

1.1 動物 健康清潔級Wistar大鼠24只，雄性，體重200～250 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 ECL化學發光試劑盒、RIPA組織蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒均為美國Pierce公司產品，小鼠ICAM-1單克隆抗體、小鼠β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記兔抗小鼠IgG均購自北京博奧森生物技術有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒由南京建成生物工程研究提供。

1.3 分組 將24只大鼠隨機分為4組，每組6只，Ⅰ組為對照組，只進行麻醉不阻斷血流;Ⅱ組為缺血4 h無再灌注組;Ⅲ組為缺血4 h再灌注6 h;Ⅳ組為缺血3 h 57 min并于再灌注前給予1 min灌注、1 min缺血，重復3次后再灌注5 h 57 min。

1.4 模型制備 1 g/L拉坦(5 mg/kg)腹腔注射麻醉下，以橡皮帶環繞結扎大鼠雙后肢根部，使后肢缺血4 h，去除止血帶實現再灌注〔2〕。按各組設定時間處理動物，分別取材。

1.5 BUN及SOD檢測 按實驗設計時間處理動物，經心臟穿刺取血，留血清，采用全自動生化分析儀檢測BUN含量。取腎組織勻漿，檢測SOD含量，按試劑盒說明進行。

1.6 免疫組織化學染色 采用SP法對四組腎組織進行免疫組織化學染色。腎小管上皮細胞胞質內出現淡黃色、棕黃色、棕褐色顆粒者為陽性細胞。觀察陽性細胞染色深淺及染色范圍，判斷ICAM-1的表達情況。

1.7 Western印跡分析 首先進行蛋白質提取和分離，轉膜后分別與一抗、二抗反應進而顯色。運用美國Kodak公司黑馬凝膠分析系統軟件對Western印跡結果進行定量分析，采集積分光密度值(IOD)，結果以目的基因與β-actin的IOD比值表示。

2 結果

2.1 四組大鼠血清BUN及腎組織勻漿SOD含量比較 各組SOD變化明顯，Ⅱ組較Ⅰ組明顯下降(P＜0.05)，III組較Ⅱ組下降更為明顯(P＜0.05)，后處理組(Ⅳ組)較Ⅱ組低，較III組顯著升高(P＜0.05)。Ⅱ組與Ⅰ組比較BUN含量無顯著差異(P＞0.05)，Ⅲ組BUN水平明顯升高，后處理組相應下降，與Ⅲ組比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠血清BUN及腎組織SOD含量比較(±s)

表1 大鼠血清BUN及腎組織SOD含量比較(±s)

與Ⅱ組比較:1)P＜0.05;與Ⅲ組比較:2)P＜0.05

組別 n BUN(mmol/L) SOD(U/mg.pro)Ⅰ組 6 2.08±0.49 22.58±1.791)Ⅱ組 6 2.16±0.57 19.03±1.90Ⅲ組 6 10.30±1.971) 11.92±1.171)Ⅳ組 6 4.92±0.922) 15.95±0.791)2)

2.2 各組腎組織免疫組化染色結果 I組腎小管上皮細胞未見陽性產物，Ⅱ組可見腎小管上皮細胞少量細顆粒棕色產物，Ⅲ組可見腎小管上皮細胞大量深棕色顆粒狀陽性產物，Ⅳ組可見陽性產物表達減輕呈灶性分布。見圖1。

2.3 Western印跡檢測結果 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組ICAM-1蛋白表達水平較Ⅰ組均有增加，以Ⅲ組最高，與Ⅰ組比較有顯著性差異(P＜0.05)，Ⅳ組與Ⅲ組比較亦有顯著性差異(P＜0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠腎組織ICAM-1表達(SP，×200)

圖2 各組腎組織中ICAM-1蛋白表達的Western印跡分析

3 討論

肢體IRI后繼發的腎損傷發生機制復雜。有研究認為，腎損傷的主要發病原因是腎小管內形成的肌紅蛋白管型堵塞腎小管所致。隨著目前研究的不斷深入，發現由肌紅蛋白在酸性環境下(pH＜5.6)解離出亞鐵血紅素的作用更為重要，它可通過脂質過氧化作用使自由基增多，從而直接損傷腎小管上皮細胞〔3〕。過多的自由基可直接損傷腎小球毛細血管內皮細胞，使腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞變性、壞死，最終腎小球濾過率下降導致急性腎衰竭〔4〕;同時氧自由基還可激活核因子-κB信號傳導通路，造成細胞因子、黏附分子等過度表達。ICAM-1屬免疫球蛋白超家族成員，介導白細胞和血管內皮細胞黏附以及白細胞穿過血管壁的過程，在IRI中同樣起著重要的作用。由ICAM-1介導的白細胞與血管內皮細胞相互黏附是白細胞聚集、活化和釋放炎性介質的關鍵〔5，6〕。SOD是一種天然的抗氧化酶，是清除體內氧自由基的最主要成分。IRI時，由于氧自由基生成增多，SOD被大量消耗，因此SOD的增多是體內氧自由基產生減少的有力佐證。本實驗中IRI組BUN明顯增高，SOD顯著下降，腎損傷程度加重，ICAM-1表達增強，說明了氧自由基及ICAM-1參與了骨骼肌缺血再灌注腎損傷。因此，對抗氧自由基產生并抑制炎性細胞向組織浸潤，是防止IRI較為有效的方法。

缺血后處理是組織缺血后再灌注前給予短時間多次重復灌注-停灌處理后，繼續再灌注的一種處理方式，是近年來提出的通過調動機體內源性保護機制減輕組織器官IRI的新措施。本實驗中，與缺血再灌注組比較，缺血后處理組SOD明顯增加，BUN顯著下降，結合腎組織中ICAM-1蛋白的檢測結果，說明缺血后處理可以明顯減少自由基的產生及炎性細胞浸潤，對骨骼肌缺血再灌注腎損傷具有保護作用。有關缺血后處理阻斷ICAM-1及氧自由基產生的具體途徑仍有待進一步研究。

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4 Rubinstein I，Abassi Z，Milman F，et al.Hyperbaric oxygen treatment improves GFR in rats with ischemia/reperfusion renal injury:a possible role for the antioxidant/oxidant balance in the ischemic kidney〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2009;24(2):428-36.

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