Caspase-3在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞回輸腦缺血再灌注模型大鼠腦組織中的表達(dá)

李梅笑 李 卓 鄒立華 吳 軍 (深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 58000)

腦出血可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，損傷后的神經(jīng)再生及功能恢復(fù)備受關(guān)注。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)以多向分化、分泌營養(yǎng)因子、免疫原性弱并可透過血腦屏障在病灶定居等優(yōu)點(diǎn)，成為治療腦血管疾病的有效方法〔1～3〕。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠60只，清潔級(jí)，體重(270±20)g;Wistar大鼠乳鼠5只，清潔級(jí)，體重(10±2)g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組及MSCs治療組，每組20只。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(TAKARA公司)、倒置顯微鏡(Olympus公司)、PCR儀(eppendorf公司)、凝膠成像系統(tǒng)(伯樂公司)

1.3 MSCs的分離、培養(yǎng) 無菌分離Wistar大鼠乳鼠股骨，取出骨髓，制備成單細(xì)胞懸液，以1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%進(jìn)行傳代，傳至3～6代備用。

1.4 MSCs誘導(dǎo)神經(jīng)樣細(xì)胞 選用第3代的MSCs，調(diào)細(xì)胞濃度為5×105/ml，接種到鋪有蓋片的6孔板中，12 h后更換培養(yǎng)基 DMEM/F12(含 2%B27，EGF 40 ng/ml，bFGF 20 ng/ml)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長(zhǎng)狀況，每隔2 d半量換液1次，7 d后固定細(xì)胞。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)NSE表達(dá)。

1.5 大腦中動(dòng)脈MCAO/再灌注模型的制備 根據(jù)Longa等報(bào)道方法〔4〕，結(jié)合朱繼等改良的線栓法建立大鼠右側(cè)MCAO/再灌注模型〔5〕。采用3.5%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，固定動(dòng)物，呈仰臥位，頸部皮膚消毒，經(jīng)頸部正中切口，分離肌肉和筋膜，暴露右側(cè)的頸總動(dòng)脈 (CCA)、頸外動(dòng)脈 (ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈 (ICA)，動(dòng)脈夾夾閉ICA和ECA，小剪刀在頸外動(dòng)脈殘端做一切口，將預(yù)先準(zhǔn)備好的栓線 (表面涂有肝素)從ECA緩慢插入ICA，去除ICA處的動(dòng)脈夾，用直鑷子將栓線緩慢沿ICA的入顱方向推進(jìn)，在漁線進(jìn)入約18～20 mm處微感到阻力時(shí)，栓線已經(jīng)通過大腦中動(dòng)脈的起始部，完成一側(cè)大腦中動(dòng)脈的阻塞。移除動(dòng)脈夾，清理術(shù)野，全層縫合傷口。栓塞大腦中動(dòng)脈2 h后打開手術(shù)切口，輕輕拔出線栓，待栓頭到達(dá)分叉處停止，實(shí)施再灌注，清理術(shù)野，關(guān)閉手術(shù)切口。

1.6 RT-PCR方法檢測(cè)caspase-3 mRNA的表達(dá) 模型大鼠制備成功后2 h，MSCs治療組經(jīng)大鼠尾靜脈回輸于模型組大鼠，細(xì)胞濃度為1×106/ml，回輸1 ml，24 h后再回輸一次，回輸?shù)?天，斷頭取腦，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，根據(jù)GenBank上登陸的caspase-3基因序列，以β-actin為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)、合成引物。β-actin上游引物:5'GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT 3'，下游引物:5'AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT 3'，片段大小為147 bp;caspase-3上游序列:5'CTGGACTGCGGTATTGAG 3'，下游序列:5'AATCAAATCCGATGTTCC 3'，片段大小為489 bp。進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)MSCs誘導(dǎo)神經(jīng)樣細(xì)胞NSE表達(dá) MSCs加入誘導(dǎo)液后，倒置顯微鏡觀察6 h后細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，24 h后可見部分細(xì)胞突起，7 d后細(xì)胞變成多角形、錐形，類似神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)(見圖1)，神經(jīng)細(xì)胞球免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈NSE陽性表達(dá);而MSCs未誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細(xì)胞呈NSE陰性表達(dá)。見圖2。

2.2 RT-PCR方法檢測(cè)caspase-3 mRNA的表達(dá) 治療組caspase-3表達(dá)明顯低于模型組(P＜0.05)。治療組caspase-3表達(dá)接近于對(duì)照組(P＞0.05)。見圖3、圖4。

圖1 顯微鏡觀察MSCs誘導(dǎo)神經(jīng)樣細(xì)胞(×100)

圖2 MSCs誘導(dǎo)神經(jīng)樣細(xì)胞NSE表達(dá)(×200)

圖3 RT-PCR檢測(cè)caspase-3 mRNA在MSCs回輸腦缺血再灌注大鼠中表達(dá)

圖4 RT-PCR檢測(cè)β-actin在MSCs回輸腦缺血再灌注大鼠中mRNA表達(dá)

3 討論

在缺血腦組織的不同部位可見神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔6，7〕。caspase家族在凋亡過程中起重要作用，凋亡的最后過程是通過caspase的激活而實(shí)現(xiàn)的。活化的caspase通過酶解不同的底物蛋白產(chǎn)生不同的生物效應(yīng):(1)對(duì)凋亡抑制因子進(jìn)行滅活;(2)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu);(3)通過分離蛋白的催化及調(diào)控功能區(qū)使其獲得或失去一定的功能，從而進(jìn)一步調(diào)控相關(guān)的下游事件，如細(xì)胞皺縮、膜發(fā)皰、染色質(zhì)聚集、DNA片斷化等，導(dǎo)致凋亡的典型形態(tài)學(xué)改變。各種引起凋亡的因素，如Fas死亡因子、腫瘤壞死因子、P53等均需要激活caspase-3才能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。MSCs可隨血液循環(huán)到達(dá)全身其他器官組織，參與生理更新和病理損傷修復(fù)。MSC可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞〔8〕，可以取代已經(jīng)死亡的神經(jīng)細(xì)胞。腦梗死后神經(jīng)再生及神經(jīng)功能恢復(fù)與病灶區(qū)及病灶周圍的血管發(fā)生、重塑密切相關(guān)〔9〕。MSCs能分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)發(fā)揮重要作用。MSCs與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)，MSCs能誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)成功地將MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)樣細(xì)胞。MSCs回輸腦缺血再灌注模型大鼠后caspase-3基因下調(diào)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。治療組caspase-3表達(dá)明顯低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組caspase-3表達(dá)接近于對(duì)照組。由于MSCs具有體外培養(yǎng)擴(kuò)增比較容易且免疫原性小的優(yōu)點(diǎn)，異體移植可修復(fù)損傷的組織或治療相應(yīng)組織病變，為腦缺血治療理想的種子細(xì)胞。

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