姜黃素對人結(jié)腸癌SW620細胞凋亡機制的影響

羅 強 孫 黎 張 力 劉 華 劉開揚 (河北北方學院實驗中心，河北 張家口 075000)

結(jié)腸癌是常見惡性腫瘤，我國是結(jié)腸癌的高發(fā)國家。隨著經(jīng)濟發(fā)展，生活方式的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病日漸增多。在發(fā)病率上升的同時，結(jié)腸癌發(fā)病年齡趨向老齡化〔1，2〕。老年結(jié)腸癌在臨床、病理特征、治療及預后等方面與中青年有所不同，如:癥狀隱匿，發(fā)展較慢，惡性度較低、誤診率高，并發(fā)癥較多，術后并發(fā)癥常見，直接影響老年結(jié)腸癌的治療和預后。老年結(jié)腸癌是臨床非常常見的惡性腫瘤，近年發(fā)病率有進一步升高。有研究表明〔3～5〕，姜黃素能抑制多種體外培養(yǎng)的腫瘤細胞如食道癌、乳腺癌、肝細胞癌和腎癌等多種腫瘤細胞的生長及增殖，并誘導細胞凋亡，但姜黃素對結(jié)腸癌細胞上述方面作用的研究報道較少。本研究主要通過姜黃素對人結(jié)腸癌細胞增殖凋亡作用來探討抗腫瘤效應可能與細胞凋亡相關基因表達的調(diào)控有關。從分子生物學水平揭示作用機制，為姜黃素進一步研究開發(fā)及臨床治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 人結(jié)腸癌細胞株(SW620)由河北醫(yī)科大學惠贈。無血清細胞凍存培養(yǎng)基(RPMI1640)(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川頁生化制品有限公司)，CCK-8(上海同仁化學)，碘化丙啶(PI)(深圳晶美生物工程有限公司);異硫氰酸熒光素(FITC-p53)、PE-bcl-2(美國BD公司)。美國Spectra-Max M2e多功能微孔板檢測系統(tǒng)，美國FACSA ria流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 SW620細胞培養(yǎng) 細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用不同濃度姜黃素處理。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖抑制 取對數(shù)生長期的SW620細胞5×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，100μl/孔。用RPMI1640培養(yǎng)液將姜黃素稀釋成 5個不同濃度(0.25，0.5，0.75，1.0，1.2 mmol/L)，分別加入96孔培養(yǎng)板(100μl/孔)，每組設4個復孔，對照組加入等體積培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。然后每孔加入CCK-8 20μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后用 SpectraMax M2/M2e多功能微孔板檢測系統(tǒng)測吸光度(A490值)，按公式計算細胞抑制率:抑制率(%)=(1-實驗組平均A490值/對照組平均A490值)×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期密度為1×106/ml SW620細胞分別接種于6個50 ml的培養(yǎng)瓶，1.5 ml/瓶，待細胞貼壁后，分別加入上述5個不同濃度的姜黃素懸液1.5 ml，對照組加入1.5 ml培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，1 500 r/min，離心7 min收集細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌3次，最后1次移入1 ml離心管中，PI染色30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 流式細胞儀檢測p53，bcl-2蛋白表達 取對數(shù)生長期SW620細胞(密度為1×106/ml)分別接種于4個50 ml的培養(yǎng)瓶中，貼壁后換不同濃度的姜黃素培養(yǎng)液(0.25，0.5，0.75 mmol/L)，對照組加入等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，收集細胞，分別加入20μl FITC-p53及PE-bcl-2孵育20 min，上流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對SW620細胞增殖的影響 CCK-8法檢測0.25，0.5，0.75，1.0，1.2 mmol/L 5個不同濃度的姜黃素作用 SW620細胞24 h，對SW620細胞的生長均得到明顯的抑制，并且隨著藥物濃度增加，對SW620細胞抑制率增加且生存率下降，分別為 19.05%、28.13%、40.95%、43.81%、51.43%;80.95%、71.87%、59.05%、56.19%、48.57%。與對照組相比差異均有顯著性(P＜0.01)。

2.2 姜黃素對SW620細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測經(jīng)不同濃度姜黃素處理的SW620細胞，均出現(xiàn)一個亞二倍體的凋亡峰，其峰值(即凋亡細胞的細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值)隨姜黃素濃度增高逐漸增高。其峰值分別為5.53%、7.12%、10.34%、21.14%及29.68%。對照組無亞二倍體凋亡峰，見圖1，圖2。

2.3 姜黃素對SW620細胞p53和bcl-2表達的影響 經(jīng)0.25，0.5，0.75 mmol/L 3個不同濃度的姜黃素作用SW620細胞24 h后，與對照組相比，p53表達明顯增高，bcl-2表達顯著降低，用藥前后均有顯助性差異，且姜黃素對SW620細胞的作用呈劑量依賴性。見表1。

圖1 對照組流式檢測結(jié)果

圖2 0.75 mmol/L姜黃素組流式檢測結(jié)果(↘為凋亡峰)

表1 姜黃素對SW620細胞p53和bcl-2蛋白表達的影響(%)

3 討論

姜黃是一種常見的中藥〔6〕，從姜黃中提取的酚性色素姜黃素是姜黃的主要有效成分，具有多方面的藥理作用，有消炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、降血脂等作用〔7〕。姜黃素的抗癌機制是多方面的，其中誘導腫瘤細胞凋亡的機制受到人們的廣泛關注。姜黃素可以抑制P-糖蛋白的功能和表達，激活半胱天冬酶-3，對多藥耐藥性人類胃癌細胞系(SGC7901)/長春新堿(VCR)起逆轉(zhuǎn)作用〔8〕，孫軍等〔9〕通過姜黃素作用于人肝癌細胞株(BEL-7402)的實驗研究證實，姜黃素可通過蛋白酶體途徑減少人肝癌細胞缺氧誘導因子(HIF-1α)蛋白的表達。研究表明，姜黃素可以上調(diào)p53絲氨酸磷酸化和Bax的水平，同時下調(diào)Bcl-2、半胱天冬酶前體-3(pro-caspase-3)和半胱氨酸前體-9(pro-caspase-9)的水平，從而誘導結(jié)腸癌細胞(HT-29)的凋亡，提示其可作為一種有效的治療結(jié)腸癌的藥物〔10〕。

CCK-8法檢測5個不同濃度的姜黃素作用SW620細胞24 h，對SW620細胞的生長有不同程度的抑制作用，并且隨著藥物濃度增加，對SW620細胞抑制率也增加、生存率下降。目前認為細胞凋亡的處罰是一個有多基因參與的級聯(lián)式表達結(jié)果，藥物誘導腫瘤細胞凋亡受一個或多個基因的調(diào)控。癌基因在正常細胞就存在，且在生理狀態(tài)下參與細胞的正常生長、分化及代謝過程。抑癌基因是一列可以抑制細胞生長并能潛在抑制癌變的基因〔11〕。癌基因與抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，癌基因增強細胞增殖，導致腫瘤發(fā)生，抑癌基因誘導凋亡清除癌變細胞，凋亡基因和抑癌基因廣泛用于癌癥的基因治療〔12〕。流式細胞術結(jié)果表明姜黃素具有上調(diào)抑癌基因p53的表達，下調(diào)癌基因bcl-2的表達作用，而誘發(fā)SW620細胞凋亡。

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8 Tong QS，Zheng LD，Lu P，et al.Apoptosis-inducing effects of curcumin derivatives in human bladder cancer cells〔J〕.Anti Cancer Drugs，2006;17(3):279-87.

9 孫 軍，李 巖.姜黃素對人肝癌細胞BEL-7402中HIF-1α表達的影響〔J〕.中國藥理學通報，2006;22(11):1379-83.

10 Song G，Mao YB，Cai QF，et al.Curcumin induces human HT-29 colon adenocarcinoma cell apoptosis by activating p53 and regulating apoptosis-related protein expression〔J〕.Braz JMed Biol Res，2005;38(12):1791-8.

11 李 鵬，李祺福，黃胤怡.腫瘤治療的新途徑-中藥有效成分誘導惡性腫瘤細胞分化〔J〕.生物學通報，2002;37(3):8-11.

12 EI-Aneed A.Current strategies in cancer gene therapy〔J〕.Eur J Pharmacol，2004;498(1-3):1-8.