大鼠急性牙髓炎造成中樞致敏時三叉神經脊束核極間亞核和孤束核c-fos蛋白的時程變化*

顧 斌 劉洪臣 馬軍利 郭 宏

神經系統內c-fos蛋白的表達及分布特點可以做為生物學指標，衡量外周刺激引起相關神經元的傷害性反應，探索神經網絡的調節變化機制。本實驗在前期建立大鼠急性牙髓炎模型的基礎上，通過測定牙髓炎致敏過程中延髓中三叉神經脊束核極間亞核和孤束核c-fos蛋白的表達情況，研究c-fos變化規律。

1.材料與方法

1.1 動物模型及實驗分組 選取SD大鼠30只，將其平均分為5組，一組為正常對照組，其余4組為實驗組，分別為開髓后封脂多糖(Lipopolysac charide，LPS)6小時、12小時、24小時、48小時組[1]。

1.2 材料 兔抗c-fos抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；二步法免疫組化試劑盒(中山金橋生物技術公司)，DAB試劑盒(中山金橋生物技術公司)。

1.3 免疫組化實驗 在預定時間點灌注取出延髓，置于4%多聚甲醛固定液中固定10h(4℃)。制備石蠟切片，以閂平面為基準，連續切片，片厚40μm，每5張取1片；尾側切取8組切片，長約1.6mm，吻側切取5組切片，長約1mm(包含Vc核)，置于4℃保存，切片均由解放軍總醫院病理科制備。

取一套切片脫蠟；3%H2O2室溫孵育5-10min，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃-98℃之間并持續10-15min，取出容器，室溫冷卻10-20min，PBS洗5min；5-10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育30min。傾去血清，滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育1-2h或4℃過夜(同時做不加一抗的陰性對照)；PBS沖洗后滴加適當比例稀釋的二抗稀釋液，37℃孵育30min；DAB顯色；另取一套切片不加抗體做為陰性對照組。

每張切片相應的核團均取四個高倍視野，計數c-fos陽性神經元數目，計算各組動物Vi和NTS內c-fos表達數目的均值,以均數±標準差表示。

1.4 統計分析 統計過程采用SPSS軟件進行方差分析。

2.結果

用免疫組化方法觀察c-fos在Vi核、孤束核的表達情況。陽性細胞計數結果見表1，總體變化趨勢見圖1-圖3。

在LPS致急性牙髓炎致敏后，與對照組相比，實驗側Vi核c-fos陽性神經元表達數目明顯增加(p＜0.01)，并呈時間依賴性，從6小時至12小時表達上升；對側Vi核的c-fos表達數目少于實驗側(p＜0.01)，變化趨勢為逐漸增多(圖1、圖2)。

與對照相比，在炎癥形成的全程(6h至48h)，雙側孤束核的c-fos陽性神經元數目均顯著增加(p＜0.01)，6h最高，之后隨時間增加而逐漸降低(圖 3)。

3.討論

圖1 牙髓炎致敏后Vi、NTS核實驗側c-fos陽性神經元數變化趨勢圖(*p＜0.01，與前一時間點比較)

圖2 Vi核實驗側和對側fos陽性神經元表達變化趨勢(#p＜0.01,與對側對比 *p＜0.01，與前一時間點比較)

圖3 孤束核實驗側和對側c-fos陽性神經元表達變化趨勢(#p＜0.01,與對側對比 *p＜0.01，與前一時間點比較)

表1 急性牙髓炎致敏大鼠Vi核、孤束核c-fos蛋白的陽性表達數目(均值±SD)

機體接受不同傷害性刺激時，中樞神經系統可發生功能和結構的變化，此時，腦干中相關核團c-fos的時空分布出現特定的變化規律，反映中樞致敏的具體信息[2]。皮膚損傷、關節損傷、內臟損傷會造成中樞神經系統c-fos蛋白不同的表達模式。研究c-fos蛋白的變化對理解外周炎癥與外周神經系統、中樞神經系統致敏的相互關系具有重要的意義，對于后期疼痛的治療也很有幫助。

在前期的實驗中，我們研究大鼠急性牙髓炎造成中樞致敏時Vc核內c-fos蛋白的變化情況，發現在封藥后12h至24h，Vc核c-fos陽性神經元表達數目顯著增多[3]。

有研究證實，三叉神經脊束核的Vi核也參與了牙齒感覺信號的傳遞過程，一些電生理和c-fos研究發現，當牙髓接受化學刺激或電刺激時，Vi的神經元會被激活[4,5]。神經解剖學研究也證實，三叉神經脊束核吻側亞核(Vo)的神經元部分直接投射到Vc核,而支配牙髓感覺的傳入神經纖維直接投射到Vo，Vi[6]。本實驗發現位于Vc核吻側的Vi核神經元c-fos表達變化趨勢類似于VC核團，只是陽性神經元的密度低于尾側亞核，與對照組相比，實驗側Vi核6-48小時表達均增強(p＜0.01),說明Vi參與了中樞致敏的進程。在2007年，worsley等[7]對牙齒施加電刺激，發現Vi區沒有明顯的c-fos表達。這可能是由于動物種屬和刺激方式的差異造成的。

在本研究中，對側Vi核在24小時以后才表達增加(p＜0.01)，這可能是由于Vi的神經元電生理特點類似與VC深層的神經元，含有較多的廣動力(wide-dynamic-range WDR)神經元，神經信號需要通過多級傳導才能激活。

實驗中，我們觀察到雙側孤束核均出現了急性的c-fos表達增高現象，在6h最高，以后逐漸降低(圖3)，這可能與動物的情感及應激性刺激有關,需要進一步研究分析。

本研究進一步說明在大鼠牙髓炎發展進程中，中樞相關核團的變化情況，反映出中樞致敏與牙髓炎進展的相關性。

[1]顧 斌，劉洪臣，馬軍利，等.大鼠急性牙髓炎動物模型的建立[J].中華老年口腔醫學雜志，2009，7(5)：304-307

[2]Navarro VP,Rocha MJ,Branco LG.Reduced central c-fos expression and febrile response to repeated LPS injection into periodontal tissue of rats[J].Brain Res,2007，1152：57-63

[3]顧 斌，劉洪臣，馬軍利，等.急性牙髓炎致敏時Vc核c-fos蛋白的時程變化[J].中華老年口腔醫學雜志，2010，8(6)：321-323

[4]Allen GV,Barbrick B,Esser MJ.Trigeminal-parabrachial connections：possiblepathway for nociception-induced cardiovascular reflex responses[J].Brain Res， 1996， 715(1-2)：125-135

[5]Hamba M.Stimulation-induced responses of the trigeminal caudal neurons in the brainstem preparation isolated from newborn rats[J].Brain Res，1998，785(1)：66-74

[6]Marfurt CF,Turner DF.The central projections of tooth pulp afferent neurons in the rat as determined by the transganglionic transport of horseradish peroxidase[J].J Comp Neurol,1984，223(4)：535-547

[7]Worsley MA,Davies SL,Clayton NM,et al.The effect of inflammation on Fos expression in the ferret trigeminal nucleus[J].Eur J Oral Sci，2007，115(1)：40-47