RhoA參與緩激肽調節緊密連接相關蛋白occludin分布和表達的作用

馬 騰，王 萍，薛一雪

(中國醫科大學基礎醫學院神經生物學教研室，沈陽110001)

研究顯示，化療藥物進入腦膠質瘤組織必須通過血腫瘤屏障(BTB)，BTB在很大程度上影響其化療效果［1］;腫瘤組織的化療藥物濃度提高2倍，其療效增加10倍，增加腦膠質瘤組織中的化療藥物濃度是提高其療效的重要因素。國內外研究表明，小劑量緩激肽(BK)及其受體激動劑RMP-7能增加BTB通透性，兩者的作用及機制基本相似。目前，對BK及其受體激動劑增加BTB通透性的機制仍不明確。研究證明［2］，BK可降低腦微血管內皮細胞(RBMECs)膜上的緊密連接相關蛋白occludin表達，通過開放緊密連接(TJ)的細胞旁途徑開放BTB，但其具體機制不明。RhoA/ROCK 信號通路參與許多血管活性物質介導的內皮細胞通透性升高過程［3］。以往研究證明，ROCK參與BK介導的BTB通透性增加［4］。為探討RhoA參與BK對occludin分布和表達的調節作用，2009年3月～2010年3月，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 Nuserum血清(BD Biosciences);FBS(Hyclone公司);occludin抗體(Zymed);RhoA特異性抑制劑肉毒梭菌C3胞外酶、DMEM培養液、BK(Sigma)。

1.2 實驗方法

1.2.1 RBMECs原代培養和體外BTB建模 將48只3～5 d的胚胎大鼠用CO2吸入法處死，開顱取其大腦皮質。分離培養大鼠RBMECs及體外BTB建模方法參考文獻［2，5］。將大鼠分為6組各8只，即對照組、BK 0 min組(A 組)、BK 5 min組(B 組)、BK 10 min組(C組)、BK 15 min組(D組)和BK 15 min+C3胞外酶組(E組)。對照組加等量無菌生理鹽水1 μmol/L 處理 15 min;A、B、C、D 組分別在不同時間加BK處理;E組將C3胞外酶50 μg/ml加入Transwell上室中，4 h后移去上室培養基，向上室加BK 1 μmol/L 作用15 min。

1.2.2 跨內皮細胞電阻抗(TEER)檢測 應用Millicell-ERS電阻測量系統，檢測各組體外 BTB的TEER。

1.2.3 Western-blot法檢測occludin表達 當Transwell上室的細胞生長到融合時，先用PBS沖洗，再用細胞鏟刮取下，倒入裂解液A 1 ml中，勻漿、離心，上清液為蛋白樣品液。抗 occludin抗體(1∶600)、抗 β-actin 抗體(1∶1 000)4 ℃孵育、二抗孵育、發光、顯像，所得圖像進行定量分析，測量整合光密度值(IDV)。

1.2.4 免疫熒光法觀察 occludin分布 將單層RBMECs用冷冰固定，0.5%TritonX-100透化，5%BSA封閉。occludin(1∶200)孵育后，用熒光二抗(1∶200)避光孵育，封片，觀察，采集圖像。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，兩組數據比較用t檢驗，多組間比較用Bonferroni檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組TEER值比較 見圖1。

圖1 各組TEER值比較

2.2 各組occludin表達比較 見圖2。

圖2 各組occludin表達比較

2.3 occludin分布 A組occludin在RBMECs膜上呈連續分布;B組occludin在細胞膜上不連續分布，且表達減少，occludin由細胞膜向細胞質轉移;E組occludin部分恢復呈連續分布，occludin由細胞膜向細胞質的轉移明顯減少。

3 討論

我們以往研究發現，BK可明顯降低TEER，增加體外BTB模型的通透性，與Liu等［2］報道一致。本研究顯示，C3胞外酶可抑制體外BTB模型TEER降低，證明RhoA信號分子參與BK介導的BTB開放。

Occludin是構成TJ的主要跨膜蛋白，TJ是構成BTB的重要結構。細胞膜上的occludin蛋白表達減少時，提示TJ開放，BTB通透性增加。本研究發現，BK可明顯降低細胞膜上的occludin表達，C3胞外酶可明顯抑制其表達下降，說明RhoA信號分子參與BK介導的BTB通透性增加;還發現BK可使occludin重新分布，C3胞外酶可抑制BK使occludin重分布的作用。Russ等［6］研究表明，RhoA信號分子可誘導應力纖維形成，引起occludin重新分布，增加內皮細胞的通透性。本研究結果與文獻報道［6］一致，說明BK也能引起occludin重新分布，使BTB開放;但C3胞外酶不能完全抑制BK的效應，提示可能有其他信號傳導通路參與BK開放BTB的過程。

綜上所述，RhoA信號分子參與BK對occludin的分布和表達調節，以及BTB通透性升高過程;但是否有其他信號傳導通路參與此過程調節仍不明確，有待于深入研究。

［1］Erdlenbruch B，Schinkhof C，Kugler W，et al.Intracarotid administration of short-chain alkylglycerols for increased delivery of methotrexate to the rat brain［J］.Br J Pharmacol，2003，139(4):685-694.

［2］Liu LB，Xue YX，Liu YH，et al.Bradykinin increases blood-tumor barrier permeability by down-regulating the expression levels of ZO-1，occludin，and claudin-5 and rearranging actin cytoskeleton［J］.J Neurosci Res，2008，86(5):1153-1168.

［3］Sun H，Breslin JW，Zhu J，et al.RhoA and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability［J］.Microcirculation，2006，13(3):237-247.

［4］馬騰，薛一雪.Y-27632抑制緩激肽選擇開放血腫瘤屏障的研究［J］.解剖科學進展，2009，15(4):400-402.

［5］Fan L，Liu Y，Ying H，et al.Increasing of blood-tumor barrier permeability through paracellular pathway by low-frequency ultrasound irradiation in vitro［J］.J Mol Neurosci，2011，43(3):541-548.

［6］Russ PK，Kupperman AI，Presley SH，et al.Inhibition of RhoA signaling with increased Bves in trabecular meshwork cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(1):223-230.