鈣通道阻滯劑對大鼠坐骨神經嵌壓性損傷早期c-fos表達及神經病理變化的影響

徐長中，吳 樂，唐金榮，蘇建華，肖 杭

(1南京醫科大學第一附屬醫院，南京210029;2灌南縣人民醫院;3南京醫科大學神經毒理研究所)

c-fos是第三信使，可在神經細胞表達。以往認為，神經干損傷早期c-fos表達增加是參與沖動傳導軸突對傷害性刺激的反應［1］;采用一定形式刺激神經干，檢測c-fos表達部位及程度，可了解神經受損狀態［2］。研究證實，刺激興奮性氨基酸受體可增加Ca2+通道開放，增加Ca2+內流;不同性質的致病因子最終均可導致第二信使Ca2+內流，使神經細胞功能受損［3］。早期使用鈣通道阻滯劑(CCB)可保護受損細胞的重要功能［4］，但其確切機制不明。2003～2005年，為探討CCB對大鼠坐骨神經損害的保護機制，我們進行了相關研究?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物及試劑 SD大鼠288只，雌雄各半，體質量180～220 g，由上海斯萊克實驗動物公司提供。禁食12 h后，按體質量隨機分為對照組(A組)、生理鹽水組(B組)、氟桂利嗪低劑量組(C1組)與高劑量組(C2組)各72只。CCB為氟桂利嗪(西安楊森)，試劑為Trizol試劑(Invitrogen公司)、逆轉錄試劑盒(Promega公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 周圍神經損傷模型制作 模型制作前30 min，C1組、C2組分別腹腔注射氟桂利嗪1、2 mg/kg，B組注射等量生理鹽水。大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后，于右后肢后側切開，鈍性分離肌肉組織，暴露坐骨神經。其中A組在坐骨神經暴露后關閉切口;其余三組用大鼠平均體質量1/2的壓力夾住，持續30 s后松開，關閉切口。各組均注射抗生素預防感染。

1.2.2 背根神經節(DRG)、坐骨神經干分離 在實驗0、5、15、30 min，1、2、4、24 h 及4 周時分別快速處死大鼠8只，取出胸腰段脊柱。從脊柱正中剖為兩半，置于pH 7.4、滲透壓340 mOsm/L的DMEM液培養皿內。遂即從椎管內側取出脊髓、神經節、相連的神經前后根和坐骨神經干，在顯微鏡下用精細角膜剪及游絲鑷剪除與神經干相連的周圍結締組織膜。

1.2.3 c-fos mRNA檢測 嵌壓大鼠坐骨神經后0、5、15、30 min 及1、2、4、24 h 取各組 DRG，按試劑盒操作說明提取DRG RNA。采用RT-PCR方法檢測c-fos mRNA，引物序列:c-fos上游為5'-ATGATGTTCTCGGGTTTCAA-3'，下 游 為 5'-TGACATGGTCTTCACCACTC-3'，擴增片段長度為348 bp;c-jun上游為 5'-ATGACTGCAAAGATGGAAAC-3'，下游為 5'-TTGAAGTTGCTGAGGTTGG-3'，擴增片段長度為530 bp。內對照β-actin引物由北京三博遠志生物公司合成，擴增片段長度為877 bp。將提取后的RNA在70℃孵育10 min后置于冰上備用，配制RT反應液20 μl，按 30 ℃ 10 min、42 ℃ 5 min、95 ℃ 5 min、5℃5 min進行逆轉錄。RT完成后配制PCR反應液，按95 ℃預變性2 min、95 ℃變性1 min、55.5 ℃(c-fos)/56℃(c-jun)退火1 min、72℃延伸1 min進行擴增，共循環35次，最后72℃延伸2 min。反應完畢，將PCR產物加入加樣緩沖液，置1%瓊脂糖凝膠、80 V恒壓電泳30 min后，在紫外光燈下進行陽性條帶密度掃描，計算c-fos mRNA表達水平。RT-PCR結果經圖像分析軟件作半定量分析。

1.2.4 DRG的病理學檢測 第4周末處死各組大鼠，按本文1.2.2方法取出其DRG及坐骨神經，在光鏡下檢查其病理變化。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，數據用±s表示，組間比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 c-fos mRNA表達 各組0、5、15 min時的c-fos mRNA表達無統計學差異(P均 ＞0.05);其0、30 min及1、2 h的c-fos mRNA表達見表1。

表1 各組0、30 min及1、2 h的 c-fos mRNA表達(±s)

表1 各組0、30 min及1、2 h的 c-fos mRNA表達(±s)

注:與同組0 min比較，*P ＜0.05;與 A組同期比較，△P ＜0.01;與 B 組同期比較，#P ＜0.01;與 C1組同期比較，▲P ＜0.05

檢測時間 A組(n=8) B組(n=8) C1組(n=8) C2組(n=8)0 min 18.875 ±3.271 18.750 ± 3.694 18.375 ±3.73919.000 ±4.106 30 min 19.000 ±3.665 53.250 ±11.817＊△ 47.000 ±4.876＊△# 34.375 ±6.255＊△#▲1 h 18.250 ±3.882 61.250 ±12.646＊△ 50.125 ±9.761＊△# 37.125 ±9.598＊△#▲2 h 18.375 ±4.868 47.375 ±10.623＊△ 38.500 ±7.407＊△# 30.250 ±8.049＊△#▲

2.2 DRG的病理改變 A組未見明顯病理改變。B組表現為眾多細胞核電子密度減低，核仁、核結構消失，空泡變性，核膜不完整;胞質中電子密度增加，片塊狀均質性變和空泡變性;可見凋亡小體。C1組、C2組表現為少數細胞核電子密度減低，核仁、核結構消失，空泡變性，核膜不完整;胞質中電子密度增加，片塊狀均質性變和空泡變性;偶見凋亡小體。C2組病變輕于C1組。

3 討論

研究發現，c-fos表達升高是參與沖動傳導軸突對傷害性刺激的反應［1］;壓迫L5神經根可致c-fos表達升高［5］;阻斷 N-甲基-D-天冬氨酸門控型及 L型 Ca2+通道可下調新紋狀體早期 c-fos表達［6］;CCB及細胞內Ca2+螯合劑可使大腦皮質細胞損傷后大鼠早期c-fos表達下調。本研究顯示，嵌壓大鼠坐骨神經干后，其c-fos表達升高后迅速下降;與B組比較，C1、C2組的c-fos mRNA及c-fos蛋白表達降低，以C2組顯著;其可能機制是Ca2+激活或上調c-fos表達，而CCB氟桂利嗪阻斷了Ca2+內流，故使早期DRG細胞c-fos表達下調。本研究結果與文獻報道［1～3］相近。Patro等發現，氟桂利嗪能使大鼠DRG神經元丟失明顯減少。本研究顯示，CCB可減輕大鼠急性坐骨神經嵌壓性損傷后的病理損害，促進神經損傷修復;結果與Patro等報道相近。本研究還顯示，大鼠坐骨神經嵌壓性損傷早期，c-fos表達可影響后期的病理學變化和神經傳導恢復，c-fos表達愈高，病理損害愈重;氟桂利嗪預處理后其病理變化和神經傳導改善明顯，可能與CCB阻斷Ca2+內流，使早期c-fos表達下調有關。

既往研究發現，利用一定形式刺激神經干，通過檢測c-fos表達的部位及程度可了解其神經受損狀態［3］。Matthews等［7］指出，電壓依賴性 Ca2+通道活性是維持神經遞質釋放和神經元興奮性的關鍵，早期使用CCB可保護受損神經元的重要功能。本研究顯示，大鼠坐骨神經嵌壓性損傷早期Ca2+內流致c-fos表達上調，及早應用CCB可下調其神經細胞cfos表達，從而減輕神經病理損害，起到神經保護作用。

［1］Narita M，Ozaki S，Narita M，et al.Change in the expression of cfos in the rat brain following sciatic nerve legation［J］.Neurosci Lett，2003，352(3):231-233.

［2］Kominato Y，Tachibana T，Dai Y，et al.Change in phosphorylation of ERK and Fos expression in dorsal horn neurons following noxious stimulation in a rat model of neuritis of the nerve root［J］.Brain Res，2003，967(1-2):89-97.

［3］楊大志，王坤正，陳君長，等.神經根嵌壓傷中原癌基因形態蛋白和降鈣素基因相關肽的表達［J］.中華外科雜志，2004，42(20):1236-1239.

［4］MacDonald JF，Xiong ZG，Jackson MF.Paradox of Ca2+signaling，cell death and stroke［J］.Trends Neurosci，2006，29(2):75-81.

［5］Tang JG，Chen HS，Yuan W，et al.The role of capsaicin-sensitive primary afferents in experimental sciatica induced by disc herniation in rats［J］.Spine，2008，33(2):163-168.

［6］Lee J，Rushlow WJ，Rajakumar N.L-type calcium channel blockade on haloperidol-induced c-Fos expression in the striatum［J］.Neuroscience，2007，149(3):602-616.

［7］Matthews EA，Dickenson AH.Effects spinally delivered N-and ptype voltage-dependent calcium channel antagonists on dorsal horn neuronal responses in a rat model of neuropathy［J］.Pain，2001，92(1-2):235-246.