RP-HPLC法同時測定復方益腎軟膠囊中鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和丹皮酚的含量Δ

陳娜，劉毅（1.天津市兒童醫院，天津市 300074；.天津藥物研究院，天津市 300193）

復方益腎軟膠囊是由知母、黃柏、牡丹皮、山茱萸、杜仲等多味中藥制成的復方制劑，具有滋陰降火、補益肝腎的功效。其有效成分為鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和丹皮酚等。為了有效控制該制劑的質量，本試驗應用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時對制劑中的有效成分鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和丹皮酚進行含量測定[1～5]，方法簡便、準確、重復性好，可作為該制劑的質控方法。

1 儀器與試藥

HP1100系列HPLC儀，包括G1310A泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1314A VWD可變波長檢測器、HP Rev.A.0501化學工作站（美國Agilent公司）；SD-3200型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純，水為去離子水，其他試劑均為分析純；丹皮酚（批號：708-9003，供含量測定用）、鹽酸巴馬汀（批號：732-9002，供含量測定用）、鹽酸小檗堿（批號：713-9906，供含量測定用）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；復方益腎軟膠囊（天津市兒童醫院制劑室自制，批號：20100201、20100202、20100203）。

2 方法與結果

2.1 檢測波長的選擇

取丹皮酚對照品溶液、鹽酸巴馬汀對照品溶液、鹽酸小檗堿對照品溶液和流動相，在200～400 nm波長之間進行紫外吸收光譜掃描，發現最大吸收波長為265 nm，故選擇265 nm作為同時測定這3種成分的檢測波長。

2.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖溶液（B，pH 3.10），梯度洗脫（0～30 min，27%A∶73%B→50%A∶50%B；30～35 min，50%A∶50%B→27%A∶73%B；35～40 min，27%A∶73%B→27%A∶73%B）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：265 nm。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 （1）對照品貯備液的制備：精密稱取鹽酸巴馬汀對照品5.19 mg、鹽酸小檗堿對照品8.44 mg，置同一50 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對照品貯備液。精密稱取丹皮酚對照品9.81 mg，置25 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為丹皮酚對照品貯備液。（2）混合對照品溶液的制備：精密吸取鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對照品貯備液1 mL、丹皮酚對照品貯備液2 mL，置同一25 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、丹皮酚的濃度分別為4.152、6.752、31.390 μg·mL-1）。

2.3.2 供試品溶液 取本品，研成細粉，取約0.4 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入1%鹽酸甲醇-水（7∶3）約20 mL，超聲（功率：180 W，頻率：35 kHz）提取30 min，取出，放冷，用相應溶劑稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm有機濾膜，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。

2.3.3 陰性對照溶液 按本品處方與工藝制備黃柏和牡丹皮缺味樣品，照“2.3.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.4 方法專屬性考察

在上述色譜條件下，分別取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，陰性對照在鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和丹皮酚色譜峰位置處無相應峰出現；與其相鄰的其他成分色譜峰達到基線分離，對含量測定結果無影響。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.鹽酸巴馬汀；2.鹽酸小檗堿；3.丹皮酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control；1.palmatine hydrochloride；2.berberine hydrochloride；3.paeonolin

2.5 線性關系考察

分別精密量取鹽酸巴馬汀對照品貯備液（0.1038 mg·mL-1）與鹽酸小檗堿對照品貯備液（0.1688 mg·mL-1）0.2、0.5、1.0、3.0、5.0 mL，置25 mL量瓶中，再分別精密量取丹皮酚對照品貯備液（0.3924 mg·mL-1）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置25 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別進樣20 μL，記錄色譜圖，讀取峰面積。以進樣量（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得鹽酸巴馬汀的回歸方程為Y＝4018Χ+1.52（r＝0.9999，n＝5）；鹽酸小檗堿的回歸方程為 Y＝5801.5Χ－95.2（r＝0.9999，n＝5）；丹皮酚的回歸方程為Y＝5230.3Χ－10.03（r＝0.9999，n＝5）。結果表明，三者的進樣量分別在0.01661～0.41520、0.02701～0.67520、0.15700～1.25570 μg范圍內與各自峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗

取同一混合對照品溶液適量，連續進樣6次，記錄峰面積。結果，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.88%、0.61%、0.88%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品（批號：20100201）適量，研勻，精密稱取6份，照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按樣品測定方法進行測定。結果，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、丹皮酚含量的RSD分別為1.17%、1.04%、0.66%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

取同一供試品溶液適量，于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h，在上述色譜條件下測定，對照品隨行。結果，對照品溶液中鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、丹皮酚峰面積的RSD分別為1.19%、0.77%、1.16%（n＝6）；供試品溶液中鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、丹皮酚峰面積的RSD分別為1.58%、0.71%、0.76%（n＝6），表明對照品溶液和供試品溶液在室溫放置12 h內均穩定。

2.9 加樣回收率試驗

取同一批樣品（批號：20100201）適量，研勻，精密稱定6份，每份約0.2 g，分別置25 mL容量瓶中，加入0.5 mL鹽酸巴馬汀（0.1038 mg·mL-1）、鹽酸小檗堿（0.1688 mg·mL-1）對照品溶液和1.0 mL丹皮酚（0.3924 mg·mL-1）對照品溶液，分別加入1%鹽酸甲醇-水（7∶3）約20 mL，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照樣品測定方法進樣測定，計算加樣回收率，結果分別見表1～表3。

表1 鹽酸巴馬汀加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test of palmatine hydrochloride（n＝6）

表2 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test of berberine hydrochloride（n＝6）

表3 丹皮酚加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Results of recovery test of paeonol（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品（批號：20100201、20100202、20100203）適量，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按上述方法測定鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和丹皮酚的含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（mg·g-1，n＝3）Tab 4 Results of content determination of samples（mg·g-1，n＝3）

3 討論

3.1 提取溶劑的考察

稱取樣品適量，共4份，分別置25 mL量瓶中，分別加入不同的溶劑[70%甲醇、1%鹽酸甲醇、甲醇-0.1%磷酸水溶液（1∶1）、1%鹽酸甲醇-水（7∶3）]約20 mL，超聲提取30 min，取出，放至室溫，用相應溶劑稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm有機濾膜，棄去初濾液，取續濾液進行測定。結果表明，用1%鹽酸甲醇-水（7∶3）作提取溶劑所測得樣品含量最高，因此采用它作為提取溶劑。

3.2 提取方法的考察

稱取樣品適量，共5份，分別置25 mL量瓶中，分別加入1%鹽酸甲醇-水（7∶3）約20 mL，采用不同的提取方法（加熱回流30 min、振搖30 min、超聲處理15 min、超聲處理30 min、超聲處理50 min）進行處理后放至室溫，用原溶劑稀釋至刻度，搖勻，過0.45μm有機濾膜，棄去初濾液，取續濾液進行測定。結果表明，振搖提取的各成分含量均較低；而對鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿而言，超聲和加熱回流的提取方法無明顯差異，但對丹皮酚而言，加熱回流對其含量有影響。因此，選定超聲為提取樣品的方法。進一步通過超聲時間的比較發現，超聲30 min時3種成分基本提取完全，故選定超聲30 min為宜。

3.3 對含量測定的分析討論

黃柏為本方君藥，故選用其有效成分鹽酸小檗堿與鹽酸巴馬汀作為含量測定指標，采用2005年版《中國藥典》（一部）黃柏項下的含量測定方法，效果較好。

考慮將鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹皮酚（牡丹皮的主要成分）采用同一流動相系統，比較了[1，2]乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖溶液與乙腈-0.1%磷酸（50∶50）每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g 4種流動相系統。結果，前3種流動相系統下鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的保留時間適宜，而丹皮酚的保留時間大約在40 min，保留時間較長；第4種流動相系統能在很短的時間內將3種成分分開，但由于此系統中離子對的特性，使各組分保留時間很不穩定，在此基礎上采用梯度洗脫的方法進一步試驗，最后通過優化選擇，確定出乙腈和0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖溶液兩相進行線性梯度洗脫系統。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：119.

[2]金佩芬，嵺華蓉，錢亞萍，等.HPLC法測定戊己丸中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的含量[J].中成藥，2001，23（1）：24.

[3]王曙東，宋炳生，陶建生，高效液相色譜法測定澄清劑處理黃柏水提液中小檗堿的含量[J].中草藥，2000，31（12）：911.

[4]陳立新，蔡亞敏，劉凌云，等.高效液相色譜法測定腎康口服液中鹽酸小檗堿的含量[J].中國藥房，2005，16（2）：137.

[5]范俊安，于 超，王繼生，等.重慶墊江牡丹皮丹皮酚含量動態變化研究[J].中國藥房，2006，17（5）：394.