HPLC法測定雙花顆粒中綠原酸的含量Δ

徐玲，張繼芬，吳芳洲，張輝，徐曉玉（西南大學藥學院/西南大學中藥研究所，重慶市 400715）

雙花顆粒系西南大學中醫藥學院徐曉玉教授在中醫藥理論的指導下精心研制的中藥復方制劑。其主要成分為山銀花，具有抑菌、消炎、保肝的功效[1，2]。2005年版《中國藥典》中記載山銀花含綠原酸，為其公認的主要有效成分，因此本研究采用綠原酸作為雙花顆粒含量測定的指標成分。

有關綠原酸含量測定的方法有高效液相色譜（HPLC）法[3]、薄層色譜-紫外分光光度（TLC－UV）法[4]、毛細管區帶電泳法[5]、薄層掃描法[6]等。本試驗采用HPLC法測定雙花顆粒中綠原酸的含量，方法準確、簡便、可靠，可用于雙花顆粒的質量控制。

1 儀器與試藥

1200 series HPLC儀（美國Agilent公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；JA2003N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

綠原酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110753-200413）；雙花顆粒（西南大學中藥研究所研制，規格：每袋2 g，批號：2009102502、2009102601、2009102701）；乙腈為色譜純，磷酸、甲醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品10.8 mg，置于100 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得108μg·mL-1的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 稱取雙花顆粒約2 g，研細，精密稱取約0.3 g，置25 mL容量瓶中，用50%甲醇20 mL超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）溶解30 min，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液 取不含山銀花的顆粒作為陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Shimpack VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸（10∶90）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：326 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。采用外標法進行定量。

2.3 系統適用性試驗

分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進行檢測。結果可得，綠原酸峰形良好，與其他組分能較好分離，陰性對照在綠原酸相應的保留時間附近無干擾峰。色譜見圖1。

2.4 標準曲線的制備

分別精密吸取對照品溶液（108 μg·mL-1）0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過，按上述色譜條件進樣20μL，記錄峰面積。以綠原酸進樣濃度（c）為橫坐標，峰面積積分值（A）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A＝33.795c－34.767（r＝0.9997，n＝5）。結果表明，綠原酸進樣濃度在5.4～54.0μg·mL-1范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.綠原酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test samples；C.negative control；1.chlorogenic acid

2.5 精密度試驗

取對照品溶液適量，重復進樣6次，測定綠原酸的峰面積。結果，RSD＝0.15%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣，測定綠原酸的峰面積。結果，RSD＝0.67%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：2009102701）適量，共6份，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定綠原酸的含量。結果，綠原酸的平均含量為10.01 mg·g-1，RSD＝1.4%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

稱取9份已知含量（10.12 mg·g-1，批號：2009102701）的樣品約0.15 g，精密稱定，分別加入對照品3個濃度梯度共9份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品（批號：2009102502、2009102601、2009102701）適量，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，取20μL進樣，按上述色譜條件測定峰面積，計算含量。結果，3批樣品中綠原酸的含量分別為 9.95、10.01、10.12 mg·g-1。

3 討論

3.1 檢測波長的確定

取綠原酸對照品在200～400 nm波長范圍內進行掃描。結果表明，其最大吸收值在326 nm波長處，因此選用326 nm作為檢測波長。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

3.2 流動相的選擇

試驗在檢測波長為326 nm、進樣量為20μL、流速為1.0 mL·min-1的條件下，分別以乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）、乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）、甲醇-水-冰醋酸（7∶92∶1）、乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）為流動相，測定綠原酸對照品溶液和供試品溶液。結果表明，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）時，綠原酸的保留時間為28.4 min，且峰形良好。在此條件下對樣品進行分析，綠原酸與其他組分能較好分離，故選其作為流動相。

[1]林 都，王 榮，徐曉玉，等.雙花顆粒對小鼠肝損傷的保護作用[J].西南大學學報（自然科學版），2010，32（6）：48.

[2]王 榮，林 都，徐曉玉.雙花顆粒體外抑菌效果觀察[J].西南大學學報（自然科學版），2010，32（6）：85.

[3]陳 黎，王啟斌，朱海濤，等.HPLC法測定風濕Ⅱ號合劑中綠原酸的含量[J].中國藥房，2010，21（31）：143.

[4]張 軍，莊桂東，韓榮偉，等.TLC-UV法測定金銀花中綠原酸[J].食品研究與開發，2008，29（3）：122.

[5]劉志梅，韓丹丹，李彩瑞，等.毛細管區帶電泳法測定中草藥中的有機酸[J].河北農業大學學報，2007，30（6）：114.

[6]王瑞明，靳秋萍，郝旭亮，等.薄層掃描法測定口腔寶中綠原酸含量[J].時珍國醫國藥，2003，14（6）：334.