HPLC法同時測定鈣泊三醇/倍他米松軟膏中2種主藥的含量

施燕，陳丹霞，何志高（同濟大學附屬東方醫(yī)院藥學部，上海市 200120）

鈣泊三醇/倍他米松軟膏用于穩(wěn)定性斑塊狀銀屑病的局部治療，主要含有鈣泊三醇、二丙酸倍他米松（以下簡稱倍他米松）2種成分。鈣泊三醇是維生素D3體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物骨化三醇的類似物[1]，其通過與角朊細胞內(nèi)的核受體結(jié)合，可調(diào)節(jié)角朊細胞的增殖與分化，即抑制細胞增殖、促進細胞分化，并有直接抗炎作用。為有效控制該制劑質(zhì)量，筆者建立了同時檢測其中鈣泊三醇與倍他米松含量的反相高效液相色譜法[2]，該法至今尚未見文獻報道。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2695-996高效液相色譜儀，包括高壓泵、自動進樣器、紫外檢測器和色譜工作站（美國Waters公司）。

1.2 試藥

鈣泊三醇/倍他米松軟膏（丹麥利奧制藥公司，批號：27011042005，規(guī)格：每支1 g，含鈣泊三醇50 μg、倍他米松0.5 mg）；鈣泊三醇對照品（臺灣Formosa公司，批號：0835274，純度：99.2%）；倍他米松對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：CRS100705A，按干燥品計純度：99.4%）；水為去離子水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Intersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液（0.01 mol·L－1磷酸氫二銨溶液，用磷酸調(diào)pH至6.0）＝58∶22∶20；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25 ℃；檢測波長：265 nm；進樣量：100μL。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 貯備液A：取適量鈣泊三醇對照品，精密稱定，用流動相溶解并定量稀釋制成濃度為0.5 mg·mL－1的溶液，即得。

2.2.2 貯備液B：取適量倍他米松對照品，精密稱定，用流動相溶解并定量稀釋制成濃度為1 mg·mL－1的溶液，即得。

2.2.3 貯備液C：精密量取1.0 mL貯備液A，置于20 mL棕色容量瓶中，然后精密加入5.0 mL貯備液B，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 對照品溶液：精密量取5.0 mL貯備液C，置于50 mL棕色容量瓶中，然后加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定鈣泊三醇/倍他米松軟膏約1 g，置于25 mL棕色容量瓶內(nèi)，用移液管精密加入20 mL的流動相，密塞，于50℃水浴5 min，取出劇烈振搖10 min，放置至室溫，取上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 空白輔料溶液的制備

精密稱定空白輔料軟膏約1 g（按照本品的處方工藝進行制備，但不添加上述2個主要成分），置于25 mL棕色容量瓶內(nèi)，用移液管精密加入20 mL的流動相，密塞，于50℃水浴5 min，取出劇烈振搖10 min，放置至室溫，取上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。

2.5 專屬性試驗

根據(jù)上述色譜條件，分別進樣分析空白輔料溶液、供試品溶液、對照品溶液和溶劑（流動相），記錄色譜，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.溶劑；B.對照品溶液；C.空白輔料溶液；D.供試品溶液；1.倍他米松；2.鈣泊三醇Fig 1 HPLC chromatogramsA.solvent；B.reference solution；C.blank excipient；D.sample solution；1.betamethasone；2.calcipotriol

圖1結(jié)果表明，鈣泊三醇、倍他米松所對應的色譜峰分離度良好，且輔料對2個主要成分的測定均無干擾，說明方法的專屬性強。倍他米松峰理論板數(shù)為2488，鈣泊三醇峰理論板數(shù)為2820；圖1中保留時間在5 min前的均為輔料峰。

2.6 線性關系考察

分別精密稱取12.5 mg鈣泊三醇、125 mg倍他米松對照品，置于100 mL棕色容量瓶中，加適量流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。

分別精密量取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL貯備液，置于100 mL棕色容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述各溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。分別以各主要成分的色譜峰面積（A）對溶液中各主要成分的濃度（c）進行線性回歸，得到各回歸方程詳見表1。

表1 線性回歸方程Tab 1 Linear regression equation

表1結(jié)果表明，鈣泊三醇和倍他米松檢測濃度線性范圍分別為1.25～3.75、12.5～37.5 μg·mL－1。

2.7 重復性試驗

精密量取供試品6份，按含量測定方法稀釋，測定。結(jié)果，鈣泊三醇、倍他米松的平均含量分別為101.2%和100.8%，RSD分別為0.84%和0.77%。

2.8 加樣回收率試驗

按75%、100%和125%3個不同濃度分別在空白輔料溶液中添加已知量的鈣泊三醇、倍他米松對照品，混勻，測定并計算。結(jié)果，2種成分的平均加樣回收率分別為100.4%和100.8%，RSD分別為0.75%和0.63%，詳見表2、表3。

2.9 樣品含量測定

精密稱定鈣泊三醇/倍他米松軟膏約1 g，置于25 mL棕色容量瓶內(nèi)，用移液管精密加入20 mL的流動相，密塞，于50℃水浴5 min，取出劇烈振搖10 min，放置至室溫，取上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。精密吸取樣品溶液100μL，注入液相色譜儀進行分析，記錄峰面積，并與對照品峰面積比較，按外標法計算樣品中的主藥含量。結(jié)果，3批樣品中鈣泊三醇標示含量分別為99.5%、98.5%、99.3%，平均含量為99.1%，RSD＝0.53%；倍他米松標示含量分別為99.2%、98.6%、98.8%，平均含量為98.9%，RSD＝0.31%。

表2 鈣泊三醇回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Result of recovery tests of calcipotriol（n＝9）

表3 倍他米松回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 3 Result of recovery tests of betamethasone（n＝9）

3 討論

考慮到有文獻[3]報道鈣泊三醇對光、熱比較敏感，在溶液中較容易轉(zhuǎn)化為可逆的異構(gòu)體，且與時間和溫度有關。故本方法中明確了供試品溶液與對照品溶液應在臨用前制備，且整個分析過程應快速并注意避光操作的要求。

經(jīng)方法學驗證，所建立的同時測定鈣泊三醇/倍他米松軟膏中鈣泊三醇和倍他米松的含量的方法靈敏、精密度高、回收率好，可用于該制劑的含量測定。

[1]Marty JP，Lafforgue C，Grossiord JL，et al.Rheological properties of three different vitamin D ointments and their clinical perception by patients with mild to moderate psoriasis[J].Digest of the World Core Medical Journals，2006，2（5）：12.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅤD.

[3]俞銀芳，劉兆鵬.活性維生素D3類藥物研究概況[J].中國藥物化學雜志，2006，16（5）：311.