黃瓜耐低氮基因型的篩選及遺傳分析

于明磊 秦智偉 徐靜靜 周秀艷

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

氮素是植物生長過程中所必需的大量元素之一，也是作物生長的重要限制營養(yǎng)元素。在自然環(huán)境里，即使是氮素利用率很高的作物，也不可能總是吸收到足夠多的氮。因此為了提高作物的產(chǎn)量，需要施用一定量的氮肥。據(jù)估計，化肥對世界糧食增產(chǎn)的貢獻率高達(dá)40 %～60 %（王艷朋等，2007），氮肥對增產(chǎn)的重要性不言而喻。

黃瓜（Cucumis sativus L.）是全球消費量最多的十類蔬菜之一。黃瓜喜水喜肥，對肥料尤其是氮肥的需求量大。為了提高產(chǎn)量，黃瓜生產(chǎn)中施氮量普遍過高。氮肥的過量施用不僅造成了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本的顯著提高，還引起了黃瓜果實品質(zhì)和食用安全性的降低，而且氮肥通過各種途徑大量流失還帶來了嚴(yán)重的環(huán)境問題（徐志遠(yuǎn)，2006）。目前，在黃瓜生產(chǎn)上人們試圖通過控制和減少氮肥的施用量來實現(xiàn)綠色、無公害的生產(chǎn)目標(biāo)，但產(chǎn)量受到一定程度的影響。選育具有耐低氮特性的黃瓜新品種，是減少黃瓜生產(chǎn)中氮肥施用量最有效和最簡捷的手段（Yu et al.，2004）。因此，本試驗旨在確立黃瓜耐低氮性種質(zhì)資源鑒定標(biāo)準(zhǔn)，篩選耐低氮種質(zhì)資源，并進一步探明黃瓜耐低氮性的遺傳規(guī)律，以期為選育耐低氮性強的黃瓜新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參照東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組徐志遠(yuǎn)（2006）的試驗結(jié)果，選用津研4號、635、649、F02-07、04-1-4、129-1、D0401、D0327、D0317、D0328、D0420、D0422、D0432、D0435 和 HL-3 等 14個黃瓜品種（自交系）為試材，供試材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組提供。

1.2 供試基質(zhì)

試驗所用培養(yǎng)基質(zhì)是由土壤、蛭石和河沙按20 m∶5 m∶1 m混勻而成，密度為1.0～1.3 g·cm-3，該密度有利于黃瓜根系的生長和對營養(yǎng)的吸收。其中土壤取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝站大田耕層土壤，過篩去除其中的硬塊和草屑。培養(yǎng)基質(zhì)的基礎(chǔ)肥力為全氮 0.202 %，全磷0.167 %，有機質(zhì)4.374 %，堿解氮127.9 mg·kg-1，緩效鉀920.5 mg·kg-1，速效鉀166.0 mg·kg-1，速效磷 142.0 mg·kg-1，pH 7.34。

1.3 試驗設(shè)計

采用混合基質(zhì)盆栽法，選用規(guī)格為30 cm×25 cm的瓦氏桶，每盆裝混合基質(zhì)13 kg。共設(shè)2個施氮水平：不施氮和正常施氮〔N 40 kg·（667 m2）-1〕。氮肥采用尿素，磷肥和鉀肥選用過磷酸鈣和硫酸鉀，P2O5和K2O施用總量分別為41.5 kg·（667 m2）-1和23.3 kg·（667 m2）-1。施肥分4個時期：苗期、抽蔓期、結(jié)瓜初期、結(jié)瓜盛期。苗期每隔2 d灌溉1次，每次用水量為0.5 L·桶-1；定植后每隔2 d灌溉1次，每次用水量為1 L·桶-1；結(jié)實后每隔1 d灌溉1次，每次用水量為1.5 L·桶-1。全生育期內(nèi)葉面噴施微肥2次。

篩選試驗：供試的 14個品種自南向北依次排列，采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個品種的每種施肥方式設(shè)5次重復(fù)。各個品種在盛果期（播種后102 d）取樣進行各項指標(biāo)的檢測，每個指標(biāo)進行5個平行試驗，去除2個偏離較大的數(shù)據(jù)后取均值作為檢測結(jié)果。

遺傳規(guī)律分析群體的構(gòu)建：選用篩選試驗所得的耐低氮性最弱和最強的品種，分別作母本（P1）和父本（P2）進行雜交，得到 F1群體，將 F1單株自交獲得 F2。將 F1分別與兩個親本回交，獲得BC1P1（簡稱B1，40株）和BC1P2（簡稱B2，40株）兩個回交世代。同時盆栽P1（20株）、P2（20株）、F1（20株）、F2（200株）和B1（40株）、B2（40株），即可獲得六世代聯(lián)合分析群體。所有單株在盛果期同時取樣進行耐低氮性檢測。試驗于2009年3月～2010年12月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站溫室內(nèi)完成。

1.4 檢測項目

篩選試驗所需檢測的指標(biāo)，包括兩個施氮水平下各個品種的5個形態(tài)學(xué)指標(biāo)（株高、莖粗、葉面積、葉柄長和根體積）和5個生理生化指標(biāo)〔生物量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、硝酸還原酶活性（NRA）和總含氮量〕。遺傳規(guī)律的分析群體只分析葉綠素b含量。

1.4.1 土壤肥力檢測 供試土壤基礎(chǔ)肥力的7項指標(biāo)測定方法參照南京農(nóng)業(yè)大學(xué)（1988）的土壤農(nóng)化分析方法進行：土壤有機質(zhì)測定采用電砂浴加熱-K2Cr2O7法，土壤堿解氮測定采用堿解擴散法，土壤速效磷測定采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法，土壤速效鉀測定采用NH4OAC浸提-火焰光度法，土壤pH測定采用電位法，土壤全氮測定采用H2SO4-H2O2消煮-蒸餾法，土壤全磷測定采用H2SO4-H2O2消煮-分光光度法，土壤全鉀測定采用H2SO4-H2O2消煮-火焰光度法。

1.4.2 形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測 產(chǎn)量：黃瓜植株開始結(jié)實后，每隔1 d采摘商品成熟的黃瓜果實1次，所得果實用電子天平稱量。株高：去除根和葉片后，用直尺測量子葉基部至植株頂端的長度，即為株高。莖粗：用游標(biāo)卡尺分別測量植株底部（第 3～4節(jié)）、中部（第 11～12節(jié)）和頂部（第23～24節(jié)）的莖粗，每個部位重復(fù)測量3次，取均值；然后將各個部位莖粗取平均值即得植株莖粗。葉面積：用直尺測量植株發(fā)育成熟的葉片（即最大葉片）的長和寬，并根據(jù)公式計算出黃瓜葉面積，黃瓜葉面積＝0.743×葉片長×葉片寬（裴孝伯 等，2005）。葉柄長：用直尺測量發(fā)育成熟的葉片從葉腋到葉柄與葉片上表面連接點的長度，即為葉柄長。根體積：將根系浸沒在裝滿水的溢流器中，并用量筒稱量所排出水的體積，即為根體積。

1.4.3 生理生化指標(biāo)檢測 生物量是將植株（包括果實）80 ℃烘干后，用1/100電子天平稱量所得；葉綠素a、b的含量（〔Ca〕、〔Cb〕）是盛果期采樣后，用95 %乙醇/分析純丙酮（1 V∶1 V）浸提24 h，并用分光光度法檢測；硝酸還原酶活性（NRA）測定采用活體法（郝再彬 等，2004）；總含氮量測定采用凱氏定氮法（郝再彬 等，2004）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用 Excel軟件進行正態(tài)分布檢驗，繪制頻率分布圖。采用 Hayman分析法進行遺傳分析，采用Gill等和Griffing的方法估算遺傳力（蓋鈞鎰 等，2002），其他數(shù)據(jù)處理采用Excel 2003完成。

測量結(jié)果得到各世代平均數(shù)后，為判定加性-顯性遺傳模型對黃瓜耐低氮性的研究是否適合，采用ABC尺度檢驗法。并通過t測驗分析其顯著性。A、B、C檢測結(jié)果若符合加性-顯性模型，均應(yīng)為0；若不符合加性-顯性模型，即存在上位效應(yīng)，則不等于0，因而可對A、B、C中任一值進行t測驗，Mather和Jinks也稱以上判斷模型的相符性為尺度測驗（郝再彬 等，2004）。

其中，VD屬于加性方差部分，是可固定遺傳的；VH屬于顯性方差部分，不能固定遺傳；VE表示非遺傳的環(huán)境方差；n表示代數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮肥吸收率、氮素利用率和耐低氮指數(shù)與各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

正常施氮條件下，對所檢測的〔Ca〕、〔Cb〕、NRA、總含氮量、生物量、莖粗、株高、葉柄長、葉面積和根體積10個指標(biāo)之間，以及各指標(biāo)與耐低氮指數(shù)間進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表1所示。

從表1中可以看出，〔Ca〕和〔Cb〕與耐低氮指數(shù)的相關(guān)性極為顯著，表明黃瓜耐低氮性與葉綠素含量緊密相關(guān)；NRA與耐低氮指數(shù)有一定的關(guān)系，但未達(dá)到顯著水平，與Zieserl等（1980）所指出的葉片中NRA可以作為氮代謝、產(chǎn)量和蛋白質(zhì)含量的選擇指標(biāo)觀點相一致；〔Ca〕和〔Cb〕間，植株總含氮量與生物量間，以及莖粗和葉面積間的正相關(guān)性均達(dá)到了極顯著水平；而葉柄長與〔Ca〕和〔Cb〕間的負(fù)相關(guān)性，以及根體積和株高間的正相關(guān)性也達(dá)到了顯著水平。顯然，黃瓜的各指標(biāo)之間，以及耐低氮性與各指標(biāo)間均存在著一定的關(guān)聯(lián)。

表1 正常施氮條件下各指標(biāo)以及耐低氮指數(shù)之間的相關(guān)性分析

2.2 主要指標(biāo)對耐低氮指數(shù)的通徑分析

為了進一步明確各種指標(biāo)對耐低氮指數(shù)的作用，本試驗還進行了各指標(biāo)對耐低氮指數(shù)的通徑分析。由表2中可以看出：〔Cb〕對耐低氮指數(shù)的直接貢獻最大，且顯著高于〔Ca〕對耐低氮指數(shù)的直接貢獻。但由于主要受到〔Ca〕對耐低氮指數(shù)的間接貢獻為負(fù)值的影響，使得〔Cb〕和耐低氮指數(shù)的相關(guān)系數(shù)與〔Ca〕接近。

〔Ca〕對耐低氮指數(shù)的直接貢獻的絕對值僅次于〔Cb〕。但它通過〔Cb〕對耐低氮指數(shù)的正向間接貢獻抵消了其負(fù)向直接貢獻，因此它與耐低氮的相關(guān)性表現(xiàn)為正相關(guān)。

總含氮量、莖粗和葉柄長對耐低氮指數(shù)的正向直接貢獻均較大，其中受到〔Cb〕和生物量對耐低氮指數(shù)有較高的負(fù)向影響，總含氮量和耐低氮指數(shù)的相關(guān)系數(shù)未達(dá)到顯著水平；莖粗則受到葉柄長和葉面積所引起的負(fù)向作用影響，因而和耐低氮指數(shù)的相關(guān)系數(shù)較低；葉柄長與耐低氮指數(shù)呈較低的負(fù)相關(guān)關(guān)系，則主要是由于〔Cb〕的負(fù)向間接作用較高所致。生物量對耐低氮指數(shù)的負(fù)向直接貢獻也達(dá)到了極顯著水平，但由于總含氮量所引起的正向貢獻略高于其正向貢獻，因此它與耐低氮指數(shù)間的相關(guān)系數(shù)較低。

其他各指標(biāo)對耐低氮指數(shù)的直接貢獻均未達(dá)到顯著水平。

通徑分析綜合表現(xiàn)為各項指標(biāo)對與耐低氮指數(shù)的直接貢獻絕對值大小依次為：〔Cb〕＞〔Ca〕＞總含氮量＞生物量＞莖粗＞葉柄長＞NRA＞葉面積＞株高＞根體積。綜合考慮各指標(biāo)與耐低氮指數(shù)的相關(guān)程度和對耐低氮指數(shù)貢獻的大小，選用〔Cb〕作為黃瓜耐低氮性的篩選指標(biāo)。

表2 主要指標(biāo)對耐低氮指數(shù)的通徑分析

2.3 黃瓜耐低氮性遺傳規(guī)律初探

2.3.1 耐低氮品種篩選 根據(jù)各個品種葉片內(nèi)的〔Cb〕檢測結(jié)果，對黃瓜品種資源的耐低氮性進行顯著性分析。從表 3中可以看出，D0328、津研4號和D0435葉片中〔Cb〕較高，其中D0328最高；D0422和 F02-07，04-1-4葉片中〔Cb〕較少，尤其D0422葉片中的〔Cb〕最少，故選取〔Cb〕差距最大的D0328和D0422作為雜交親本進行遺傳分析試驗，兩個親本葉片中〔Cb〕的差異達(dá)到了極顯著水平。

2.3.2 六世代聯(lián)合遺傳分析

2.3.2.1 F2群體正態(tài)性分析 為檢驗 D0422×D0328的 F2群體的正態(tài)性，對 F2群體的耐低氮性進行D’Agostino檢測，結(jié)果表明Y=-3.11>Y0.01/2=-3.30，表明 F2群體的耐低氮性基本符合正態(tài)分布，但不顯著，需進一步通過峰度和偏度進行正態(tài)性驗證。

進一步檢驗了F2群體的分離度，并通過峰度和偏度對F2單株的〔Cb〕進行定性正態(tài)性檢驗。結(jié)果見圖1。

正態(tài)性檢驗結(jié)果表明：峰度值=-0.188，偏度值=0.064，二者絕對值均小于1。說明D0422×D0328的F2頻度分布符合正態(tài)分布。F2的頻度分布圖呈正態(tài)分布，說明黃瓜耐低氮性是多基因控制的數(shù)量性狀。應(yīng)用數(shù)量性狀遺傳學(xué)對黃瓜耐低氮性進行遺傳分析是可行的。

2.3.2.2 遺傳模型分析 統(tǒng)計六世代（P1、P2、F1、F2、B1和 B2）各個單株葉片內(nèi)的〔Cb〕，并統(tǒng)計其樣本容量、樣本平均數(shù)和方差。所得結(jié)果見表4。

ABC尺度遺傳檢驗結(jié)果如下：

A尺度測驗：A=1.456，δA2=18.579，δA=4.310，t=A/δA=0.338，df=200，t0.05=1.62。

B 尺度測驗：B=0.032，δB2=16.053，δB=4.007，t=B/δB=0.008，df=200，t0.05=1.62。

C 尺度測驗：C=0.664，δC2=97.226，δC=9.860，t=C/δC=0.067，df=200，t0.05=1.62。

由以上遺傳檢驗可知，組合D0422×D0328耐低氮性經(jīng)ABC尺度檢測，其測驗結(jié)果差異均不顯著，即A=B=C=0，說明該性狀符合加性-顯性遺傳模型，同時也說明可以應(yīng)用加性-顯性遺傳模型對黃瓜進行黃瓜耐低氮性遺傳研究。

2.3.2.3 遺傳力、加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)分析 本試驗結(jié)合六世代對黃瓜耐低氮性進行了遺傳檢驗，確定黃瓜耐低氮性的遺傳模型符合加性-顯性模型，上位作用方差VI=0，進而將上述 F2世代的總表型方差可以分解為遺傳方差和環(huán)境方差兩部分。

表3 葉綠素b含量差異顯著性分析

圖1 D0422×D0328的F2群體葉片中〔Cb〕的頻度分布

表4 六世代樣本容量、樣本平均數(shù)和方差

平均顯性度<1表明，黃瓜耐低氮性非完全顯性遺傳，其加性效應(yīng)較顯著，顯性效應(yīng)較小，但不可忽略。廣義遺傳力和狹義遺傳力均較高，說明黃瓜耐低氮性的遺傳受環(huán)境影響較小，而且主要是由基因加性效應(yīng)所控制。廣義遺傳力明顯大于狹義遺傳力，說明存在顯性遺傳效應(yīng)。但環(huán)境方差在F2世代總表型方差中所占比例低，也證實了顯性效應(yīng)未占主導(dǎo)地位，環(huán)境效應(yīng)可忽視。在嚴(yán)格控制環(huán)境條件前提下，理論上可以在早期世代就根據(jù)單株的表現(xiàn)型進行選擇，而且能比較正確地判斷其基因型。黃瓜耐低氮性基因遺傳的分量比重大，因此能把黃瓜耐低氮性穩(wěn)定地傳遞給以后各世代群體。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)的耐低氮性篩選指標(biāo)（如耐低氮指數(shù)），因其結(jié)果的獲得常常需要同時檢測同一指標(biāo)在兩種不同施氮條件下的數(shù)值，不僅費時費力，而且不能實現(xiàn)對分離群體的耐低氮性的分析。所有形態(tài)學(xué)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)中，葉綠素a和葉綠素b含量這兩個指標(biāo)與耐低氮指數(shù)顯著相關(guān)。通徑分析結(jié)果表明，葉綠素b含量對耐低氮指數(shù)的貢獻最大，綜合分析后確定葉綠素b含量為黃瓜耐低氮性的最佳篩選指標(biāo)。

以葉綠素 b含量為篩選指標(biāo)，得到耐低氮性最強和最弱的兩個黃瓜品種分別為 D0328和D0422。并利用D0422×D0328構(gòu)建六世代聯(lián)合遺傳分析群體以研究黃瓜耐低氮性的遺傳規(guī)律。

F2群體呈正態(tài)性表明黃瓜耐低氮性為數(shù)量性狀；較大的廣義遺傳力和狹義遺傳力表明黃瓜的耐低氮性主要取決于基因型。黃瓜耐低氮性的遺傳主要以加性效應(yīng)為主，顯性效應(yīng)較小。因此可充分利用基因的加性效應(yīng)，在不同自交系上逐步累加高黃瓜耐低氮性基因，然后自交系之間配制雜交組合，最大限度地利用顯性效應(yīng)。因此采用常規(guī)育種法獲得黃瓜高耐低氮性新品種是可行的。

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