黑龍江省依蘭縣酸漿根腐病病原菌鑒定及生物學(xué)特性初步研究

王 勇 張晶晶 葉陽(yáng)陽(yáng) 陳 典

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

酸漿（Physalis alkekengi L.）是茄科酸漿屬多年生宿根草本植物，地下根狀莖橫生，成熟漿果橙紅色或黃色，可供鮮食和觀賞（葛玉 等，2006）。在熱帶和亞熱帶地區(qū)，酸漿作為一種常用藥物被廣泛用于治療瘧疾、哮喘、肝炎、皮炎、風(fēng)濕等疾病（甄清 等，2006），另外酸漿中的酸漿苦素還具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌、強(qiáng)心等生物活性（許亮 等，2009）。

在酸漿大面積生產(chǎn)種植中，多采用一次播種連續(xù)4～5 a采收的方法（孫偉 等，2008），其根狀莖容易發(fā)生多種病害。本試驗(yàn)以黑龍江省依蘭縣感病紅果酸漿〔Physalis alkekengi L.var francheti（Mast.）Makino〕的病根和地下莖為試材進(jìn)行病原菌分離和鑒定，同時(shí)對(duì)致病菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，旨在探討酸漿根腐病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，為制定綜合防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的鑒定

1.1.1 病樣采集及病原物分離培養(yǎng) 2008年4月～2010年10月在黑龍江省依蘭縣酸漿種植地多點(diǎn)采集病根及地下莖，采用組織分離法分離病原菌（方中達(dá)，1998），病樣組織接種于 PDA培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)（PDA中含終濃度為100 mg·L-1的鏈霉素以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)）。純化培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)入凍存管中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 致病性測(cè)定 將分離得到的優(yōu)勢(shì)菌落在PDA平板上于25 ℃、24 h光照條件下培養(yǎng)5 d，采用傷口接種法，將直徑為8 mm的菌碟直接接種于苗齡為20～25 d的酸漿幼苗地上莖部位，每種菌接種30株。接種后幼苗于溫室中培養(yǎng)，以不接菌的植株為對(duì)照。

根腐病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無(wú)癥狀；1級(jí)：須根變黑；2級(jí)：主根及地下莖變黑；3級(jí)：主根及地下莖變黑腐爛，地上部生長(zhǎng)不良；4級(jí)：根部腐爛，植株死亡。

1.1.3 病原菌形態(tài)觀察 將分離出的優(yōu)勢(shì)菌株接種到PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)5 d，肉眼觀察菌落形態(tài)特征，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗形態(tài)。根據(jù)病原菌產(chǎn)孢特征及其在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，對(duì)病原菌進(jìn)行初步鑒定。

1.1.4 病原菌產(chǎn)孢特征觀察 在SNA平板上接種直徑為8 mm的病原菌菌碟，25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，于滴有無(wú)菌水的載玻片上挑取少量菌絲，在光學(xué)顯微鏡下觀察產(chǎn)孢情況。

1.1.5 病原菌 rDNA ITS擴(kuò)增及序列分析 將酸漿根腐病致病菌接在 PDA培養(yǎng)基表面的玻璃紙上，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，取0.1 g菌絲體，加入液氮研磨，用改良的CTAB法提取病原菌基因組總 DNA（陳昆松 等，2004）。rDNA ITS擴(kuò)增采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括：10×PCR Buffer（含 Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 1 μL，DNA 模板 100 mg，10 μmol·L-1ITS1 和 ITS4各1 μL，5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

測(cè)序結(jié)果經(jīng) BLAST（http：//www.ncb.inlm.nih.gov/blast）與 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)特征及致病性測(cè)定，確定酸漿根腐病的主要致病菌。

1.2 病原菌的生物學(xué)特性研究

將致病菌的菌株移到PDA平板上培養(yǎng)3～4 d后進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.2.1 不同溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響 從上述培養(yǎng)的菌株菌落邊緣，用打孔器取直徑為8 mm的菌碟，接到PDA平板上，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，第5天用十字法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，取平均值，每處理3次重復(fù)，并記錄菌落形態(tài)、顏色變化等。

1.2.2 不同pH值對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響 用HCl緩沖液和NaOH緩沖液將PDA培養(yǎng)基pH值調(diào)成5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.06個(gè)梯度，然后將培養(yǎng)基滅菌。將直徑為8 mm的菌碟接到不同pH值的PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察方法同1.2.1。

1.2.3 不同光照對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響 設(shè)置3種不同光照條件的培養(yǎng)箱，即24 h全光照、24 h全黑暗、12 h光照與12 h黑暗交替3種處理，培養(yǎng)溫度及觀察方法同1.2.2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)計(jì)算借助于Excel軟件完成，百分?jǐn)?shù)經(jīng)反正弦平方根轉(zhuǎn)換后用SAS 6.0軟件進(jìn)行方差分析。采用Clustalx和TreeView32軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病害癥狀

受病原菌侵害的酸漿植株矮小，長(zhǎng)勢(shì)弱。發(fā)病初期，地下須根感病，變少，新生的根也很稀疏，植株基部葉片由葉尖開(kāi)始變黃，并逐漸向上部葉片發(fā)展。后期主根及根莖上可見(jiàn)黑褐色病斑，出現(xiàn)腐爛至病部組織變硬，裂口深及木質(zhì)部。直接導(dǎo)致水分與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中斷，最后導(dǎo)致整株萎蔫死亡（圖1）。

2.2 致病性測(cè)定

以酸漿感病根及地下莖為材料，進(jìn)行病原菌分離。從病變組織中共分離出7種菌株，其中3號(hào)菌株與6號(hào)菌株為廣譜性青霉菌，其他均為鐮孢菌屬病原菌。為了確定主要致病菌，首先將分離出的各病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，打成直徑為8 mm的菌碟進(jìn)行傷口接種，定期觀察。7號(hào)菌株和4號(hào)菌株在接種9 d后，接種部位出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，后期植株根部出現(xiàn)水漬狀病斑，逐漸腐爛，地上部葉片變黃并逐漸萎蔫，與健康植株比較長(zhǎng)勢(shì)弱（圖2）。1號(hào)菌株和2號(hào)菌株在接種13 d后也有癥狀出現(xiàn)，但較輕微，而5號(hào)菌株接種后沒(méi)有發(fā)病。從各致病菌回接后酸漿的發(fā)病率和病情指數(shù)可以看出（表 1），7號(hào)菌株與4號(hào)菌株為主要致病菌，將其分別命名為PHADDR07和PHADDR04。

圖1 酸漿根腐病危害癥狀

圖2 接種PHADDR07菌株和PHADDR04菌株后酸漿植株與健康植株地下部比較

從病重組織重新分離病原物，經(jīng)分離純化獲得的病原菌與原接種病原菌在菌落、分生孢子等形態(tài)特征上完全一致。根據(jù)致病性測(cè)定結(jié)果及病原菌形態(tài)特征觀察（Booth，1988），初步鑒定酸漿根腐病主要致病菌為茄鐮孢菌〔Fusarium solani（Mart.）Sacc.，PHADDR07〕和尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum Schlecht.，PHADDR04）。

表1 各分離病原菌回接后酸漿的發(fā)病率和病情指數(shù)

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 病原菌的形態(tài)特征 PHADDR07菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，菌落直徑為55～62 mm，菌落邊緣平滑，近圓形，氣生菌絲綿絨狀，白色至肉色，間有土黃色，培養(yǎng)基不變色。小型分生孢子呈卵形、洋梨形或腎形，散生，無(wú)隔或有隔；大型分生孢子為馬特形，3～5分隔，兩端較鈍圓，在菌絲頂端單生或散生。氣生菌絲上的分生孢子梗為長(zhǎng)筒形的單瓶梗（圖3）。

圖3 PHADDR07菌株孢子形態(tài)（40×）

PHADDR04菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，菌落直徑為58～70 mm，菌落呈圓形，淡粉色或洋紅色，菌落邊緣菌絲呈乳白色，培養(yǎng)基不變色。大型分生孢子呈美麗形，兩端漸尖，足細(xì)胞較明顯，多為2～4分隔；小型分生孢子呈卵形、橢圓形或腎形，假頭生，0～1分隔。分生孢子梗為單瓶梗，較短，單生或具分枝（圖4）。

2.3.2 致病菌的分子鑒定 以PHADDR04菌株和PHADDR07菌株的基因組DNA為模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，兩個(gè)菌株都擴(kuò)增出500～600 bp大小的片段（圖5），測(cè)序后顯示 PHADDR04菌株的擴(kuò)增片段為 504 bp，PHADDR07菌株的擴(kuò)增片段為529 bp。將所得序列于NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示：PHADDR07菌株的 rDNA ITS序列與F.solani的同源性達(dá)到99 %以上，而PHADDR04菌株的rDNA ITS序列與F.oxysporum的同源性達(dá)到 100 %。聚類(lèi)分析結(jié)果表明（圖 6），PHADDR07菌株和PHADDR04菌株的ITS序列都與生姜（GQ121300，GQ121304）根腐病病原菌的親緣關(guān)系最為密切，說(shuō)明二者可能具有相似的寄主范圍。

結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、致病性測(cè)定與 rDNA ITS序列分析，可以確定酸漿根腐病主要致病菌為茄鐮孢菌（F.solani）與尖鐮孢菌（F.oxysporum）。

圖5 PHADDR04菌株和PHADDR07菌株的rDNA ITS序列擴(kuò)增結(jié)果

圖6 PHADDR04菌株和PHADDR07菌株的rDNA ITS序列聚類(lèi)圖

2.4 病原菌生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響 溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)有明顯的影響，PHADDR04菌株在10～30 ℃均能生長(zhǎng)，25 ℃時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)，顯著優(yōu)于其他溫度，在低于10 ℃或高于40 ℃的條件下菌絲停止生長(zhǎng)；PHADDR07菌株在10～35 ℃均能擴(kuò)展，25～30 ℃為最適溫度域，低于10 ℃或高于38 ℃時(shí)停止生長(zhǎng)。

2.4.2 pH值對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響 pH值對(duì)菌落生長(zhǎng)有一定的影響，PHADDR04菌株與PHADDR07菌株在pH值為5.0～10.0之間均可生長(zhǎng)，但菌落大小在最適pH值與非最適pH值下存在顯著差異。尖鐮孢菌的最適pH值為7.0，菌落直徑可達(dá)62 mm；而8.0是茄鐮孢菌的最適pH值，菌落直徑為54 mm。

2.4.3 光照對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響 在相同溫度與pH值的條件下，設(shè)置全光、全暗、12 h光暗交替3種不同光照處理，觀察其對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響。光暗交替處理PHADDR04菌株與PHADDR07菌株的生長(zhǎng)都較全光和全暗處理快，但差異不顯著，說(shuō)明光照不是影響尖鐮孢菌與茄鐮孢菌生長(zhǎng)的主要因素。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)病原菌的形態(tài)學(xué)觀察、致病性測(cè)定和rDNA ITS序列分析，最終確定酸漿根腐病的主要致病菌為尖鐮孢菌（F.oxysporum）和茄鐮孢菌（F.solani）。尖鐮孢菌和茄鐮孢菌是分布廣泛的土壤習(xí)居菌，侵染能力很強(qiáng)，二者既可單獨(dú)侵染植物，也可共同侵染導(dǎo)致植物發(fā)病。周洪友等（2004）報(bào)道，茄鐮孢菌和尖鐮孢菌共同作用導(dǎo)致沙打旺根腐病發(fā)生；而辣椒根腐病（劉麗云 等，2007）、甜瓜根腐病（楊來(lái)新 等，2004）、西瓜根腐病（耿麗華 等，2010）均由茄鐮孢菌侵染所致；尖鐮孢菌侵染可導(dǎo)致馬鈴薯根腐病的發(fā)生（Manici & Caputo，2009）。

本試驗(yàn)對(duì)酸漿根腐病的兩種主要致病菌進(jìn)行了生物學(xué)特性的初步研究，結(jié)果表明：光照對(duì)兩種主要致病菌的生長(zhǎng)影響不大，尖鐮孢菌的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，致死溫度為40 ℃，在pH值為7.0的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好；茄鐮孢菌在pH值為8.0、溫度域?yàn)?5～30 ℃條件下長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)，致死溫度為38 ℃。

本試驗(yàn)確定了酸漿主產(chǎn)區(qū)黑龍江省依蘭縣根腐病的主要致病菌，并就其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，對(duì)于生產(chǎn)上根腐病防治具有一定的指導(dǎo)意義。但茄鐮孢菌和尖鐮孢菌是否存在酸漿專化型，其產(chǎn)孢特性如何以及孢子萌發(fā)的條件等還有待于進(jìn)一步研究。

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