乳腺癌組織中HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表達的臨床意義

楊黎，朱霞，常建英，冉立（貴州省腫瘤醫院乳腺婦瘤科，貴陽市 550000）

細胞周期調控機制的失衡導致細胞分化、凋亡的變化，從而腫瘤細胞不斷增殖形成了侵襲、轉移的基礎。研究細胞增殖、凋亡中的一系列分子事件變化，并結合臨床預后因素，可能將直接地指導腫瘤的診斷，確定個體化治療手段以及揭示腫瘤預后的內在生物學特征。本文檢測原癌基因人表皮生長因子受體2（HER-2）、細胞增殖標志物增殖細胞核抗原（PCNA）和凋亡相關基因Bcl-2、Bax在乳腺癌組織中的表達，分析其與臨床病理因素的關系，探討HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表達作為判斷乳腺癌生物學行為和預后指標的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床標本

50例乳腺癌根治術后標本來自我院1997年收治的HE染色病理確診的女性患者，所有病例術前未接受化療和放療。標本用10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋為存檔蠟塊。患者年齡31～68歲，中位年齡45歲；浸潤性導管癌46例，浸潤小葉癌2例，粘液癌1例，印戒細胞癌1例；腋淋巴結轉移者28例，無淋巴結轉移者22例；臨床分期Ⅰ期2例，Ⅱ期32例，Ⅲ期14例，Ⅳ期2例。

1.2 試劑

HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax蛋白的檢測一抗均為鼠抗人單克隆抗體；免疫組化Envision二步法試劑盒，購自北京中山生物技術有限公司。

1.3 免疫組化方法

存檔蠟塊連續切片，脫蠟再浸泡于梯度乙醇水化；3%過氧化氫孵育，以阻斷內源性過氧化物酶；微波抗原熱修復；滴加一抗，37℃孵育1～2 h，TBS沖洗；滴加非免疫性血清，37℃孵育20 min，TBS沖洗；滴加Envision二抗，37℃孵育20～30 min，TBS沖洗；顯色，沖洗、復染、脫水、封片。

1.4 結果判斷

HER-2陽性染色位于細胞膜，呈棕黃色染色，按Hercep Test標準評分[1]。0級:浸潤性腫瘤細胞無染色；1級:任何比例浸潤性腫瘤細胞呈弱且不完整的細胞膜染色或少于10%的腫瘤細胞呈弱且完整的細胞膜染色；2級:大于10%的腫瘤細胞呈弱或不一致的完整的細胞膜染色或小于30%的腫瘤細胞呈現強且完整的細胞膜染色；3級:大于30%的浸潤性腫瘤細胞呈強且完整的細胞膜染色。評估其蛋白表達狀況為:0級、1級為陰性，2級為不確定，3級為陽性。PCNA陽性染色位于細胞核，Bcl-2陽性染色位于細胞漿，Bax陽性染色位于細胞漿。陽性細胞染色為棕黃色或棕褐色，評估標準為:“－”為無陽性細胞；“+”為＜25%陽性細胞；“++”為25%～50%陽性細胞；“+++”為＞50%陽性細胞。

1.5 統計學處理

以SPSS 13.0軟件包對數據進行統計分析，采用χ2檢驗、校正的χ2檢驗或確切概率法，各指標的相關分析用Spearman相關性檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達情況

乳腺癌組織中HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax的表達見圖1，其中HER-2表達率為44%（22/50），PCNA表達率為82%（41/50），Bcl-2表達率為48%（24/50），Bax表達率為54%（27/50）。

圖1 HER-2（A）、PCNA（B）、Bcl-2（C）、Bax（D）在乳腺癌組織中的表達（Envision×200）Fig 1 The expression of HER-2（A），PCNA（B），Bcl-2（C），and Bax（D）in breast cancer tissue（Envision ×200）

2.2 乳腺癌HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表達與臨床病理因素之間的關系

因50例乳腺癌病理類型中浸潤性導管癌占絕大多數，其他類型例數少，故未作統計分析。Ⅰ、Ⅳ期病例各2例，故將Ⅰ、Ⅱ期合并，Ⅲ、Ⅳ期合并。乳腺癌組織中HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax的表達與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移狀態和臨床分期的關系如表1所示。

表1 HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax陽性表達與臨床病理因素之間的關系Tab 1 Relation between HER-2，PCNA，Bcl-2 and Bax expression and clinicopathological factors

HER-2在淋巴結轉移組的陽性表達率為57.1%，高于無淋巴結轉移組的27.3%（P＜0.05）；在Ⅲ～Ⅳ期的陽性表達率為62.5%，高于Ⅰ～Ⅱ期的35.3%，差異無統計學意義，但卡方值接近臨界值，在進行數據分析時可有趨向性。

PCNA與腫瘤大小明顯相關，在腫瘤直徑≥4 cm的患者中陽性表達率高達96.6%，在＜4 cm組陽性表達率為61.9%（P＜0.01）。

Bcl-2與年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移及臨床分期無關。

Bax在淋巴結轉移組的陽性表達率為67.9%，無淋巴結轉移組為36.4%，差異有統計學意義（P＜0.05）；在Ⅲ～Ⅳ期組的陽性表達率為75.0%，高于Ⅰ～Ⅱ期組的44.1%（P＜0.05）。

2.3 乳腺癌HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表達與淋巴結轉移狀況的相關分析

經Spearman等級相關性檢驗，與淋巴結轉移相關的指標有HER-2、Bax，且呈正相關（相關系數均為0.284，P＜0.05），進一步驗證了上面的結果；Bcl-2與淋巴結轉移的相關系數為負值，但差異無統計學意義。

3 討論

HER-2是一種原癌基因，編碼P185跨膜蛋白，是表皮生長因子受體家族成員之一，具有酪氨酸激酶活性，激活后可傳導致分裂信號。HER-2癌基因的激活方式表現為基因擴增與蛋白過表達。文獻報道[2，3]，免疫組化技術（IHC）檢測HER-2表達率在10%～54%之間。采用IHC與直接基因檢測水平的熒光原位雜交（FISH）方法相比，檢測符合率達96%[4]。本課題采用臨床最常用的IHC檢測HER-2基因在細胞表面的蛋白表達水平，其表達率為44%。大多數研究已表明[5，6]，HER-2的改變與乳腺癌的不良預后有關，HER-2陽性者腫瘤的惡性程度較高、激素受體水平較低、腫瘤較大、多有淋巴結轉移、總生存期較短，而且一旦病情復發，HER-2陽性者對激素和化療的反應率均很低，因而HER-2又可作為對激素或化療有否反應的預示指標。HER-2表達增高與臨床病理因素關系的研究較多，但結果不盡一致。在本研究中，有淋巴結轉移的病例中HER-2表達率顯著高于無淋巴結轉移病例，相關分析亦提示HER-2與淋巴結轉移呈正相關；另外，臨床分期晚的病例顯示出HER-2表達率高的傾向性。專門針對HER-2陽性乳腺癌的分子靶向藥物——曲妥珠單抗，就是以腫瘤細胞表面的HER-2為靶點，通過阻斷HER-2引導的細胞信號通路，從而抑制腫瘤細胞的生長。目前美國國家綜合癌癥網（NCCN）和中國版cNCCN指南已將其推薦為HER-2陽性乳腺癌患者的標準治療。與傳統化療相比較，曲妥珠單抗只靶向作用于腫瘤細胞而避免殺傷正常細胞，因此不會產生嚴重的惡心、嘔吐、貧血、脫發等不良反應。

PCNA又稱周期蛋白，是DNA聚合酶的輔助蛋白，作用于DNA合成過程，特別是G1晚期與S期，是判定細胞增殖活性的內源性標志物，已證實PCNA的合成和表達與細胞增殖狀態相關，即PCNA表達越高，細胞增生越活躍[7]。研究表明，PCNA與乳腺癌的分期、療效、預后有密切的關系[8，9]。本組資料PCNA的表達率為82%，PCNA表達者腫瘤組織體積較大。PCNA在淋巴結轉移及臨床分期晚的病例中有高表達的趨勢，但無明顯差異性。分析原因，一是本組病例數較少，可能沒有很好地反映PCNA與淋巴結轉移的相關性；二是可能PCNA只代表腫瘤細胞增殖活性而不代表腫瘤組織的侵襲性。因此，PCNA與乳腺癌轉移是否有關，仍需作進一步的研究。

腫瘤的發生和發展不僅取決于細胞的增殖率，也取決于細胞的凋亡率。Bcl-2和Bax已知是一對作用相反的凋亡抑制基因和促進基因，Bcl-2基因表達往往與好的生物學特性相關[10，11]。本組資料以往的研究結果顯示[12]，通過多因素COX模型分析Bcl-2可作為判斷乳腺癌生存期長短的指標，Bcl-2表達預示患者生存期較長。然而，在本研究中Bcl-2與腫瘤大小、分期及淋巴結轉移等臨床病理因素均無關，這可能是單因素分析中未控制其他因素對乳腺癌原發灶大小和淋巴結轉移的影響，故未體現Bcl-2表達的統計學意義。本研究顯示，Bax表達與淋巴結轉移及臨床分期晚有關，表明了Bax與不良的生物學特性相關，結論與當前的多數研究一致[13]。

隨著分子生物學的發展，從基因水平探討乳腺癌發生、發展的規律，已成為近年來研究的熱點。臨床上早期將具有高危因素及潛在轉移危險的乳腺癌患者篩選出來，進行針對性的治療是提高乳腺癌生存率、減少復發和轉移的關鍵。本研究結果表明，HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax可作為判斷乳腺癌預后的可靠指標，聯合檢測多個預后因子，全面判斷患者的預后，早期篩選出具有高危因素的患者，給予積極治療，將在很大程度上提高患者的術后生存率。

[1]Wolff AC，Hammond ME，Schwartz JN，et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer[J].J Clin Oncol，2007，25（1）:118.

[2]Hussein MR，Abd-Elwahed SR，Abdulwahed AR.Alterations of estrogen receptors，progesterone receptors and c-erbB2 oncogene protein expression in ductal carcinomas of the breast[J].Cell Biol Int，2008，32（6）:698.

[3]付 強，于世英，許三鵬.乳腺癌HER-2過度表達預后相關因素研究[J].腫瘤防治研究，2008，35（S1）:9.

[4]Nichols DW，Wolff DJ，Self S，et al.A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer[J].Ann Clin Lab Sci，2002，32（1）:3.

[5]Kostopoulos I，Arapantoni-Dadioti P，Gogas H，et al.Evaluation of the prognostic value of HER-2 and VEGF in breast cancer patients participating in a randomized study with dose-dense sequential adjuvant chemotherapy[J].Breast Cancer Res Treat，2006，96（3）:251.

[6]李 明，閆 豐，邰智慧，等.C-erbB-2、P53及PCNA在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義[J].山東醫藥，2010，50（24）:55.

[7]Ando T，Kawabe T，Ohara H，et al.Involvement of the interaction between p21 and proliferating cell nuclear antigen for the maintenance of G2/M arrest after DNA damage[J].J Biol Chem，2001，276（46）:42971.

[8]李艷萍，張 斌，喻衛紅，等.Bcl-2、C-erbB2和PCNA表達與乳腺癌新輔助治療療效關系的研究[J].中國腫瘤臨床與康復，2007，14（1）:8.

[9]張德才，張景華，汪 萍，等.C-erbB2、PCNA、ER、PR在126例乳腺癌中的表達及臨床意義[J].現代腫瘤醫學，2009，17（10）:1874.

[10]Lee KH，Im SA ，Oh DY，et al.Prognostic significance of Bcl-2 expression in stageⅢbreast cancer patients who had received doxorubicin and cyclophosphamide followed by paclitaxel as adjuvant chemotherapy[J].BMC Cancer，2007，7:63.

[11]侯金超，薄愛華，王發亮，等.腫瘤標志物Bcl-2和cerbB-2在乳腺癌中的表達及其臨床意義[J].實用腫瘤雜志，2008，23（2）:139.

[12]楊 黎，朱 霞，冉 立.HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax在乳腺癌組織中的表達與預后的關系[J].癌癥，2007，26（7）:756.

[13]曲文志，涂 巍，于作夫，等.Bcl-2和Bax的表達與乳腺癌組織學分級及預后的關系[J].現代腫瘤醫學，2008，16（10）:1692.