2種左甲狀腺素鈉片的人體生物等效性研究

王蒙，周文佳，黃明，張全英（蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，蘇州市 215004）

左甲狀腺素鈉（Levothyroxine sodium，L-T4）是一種合成的甲狀腺素鈉，與甲狀腺素（T4）作用相同。L-T4可作為替代或補(bǔ)充治療不同的病因引起的先天性或獲得性甲狀腺功能減退癥，其可用于亞臨床甲狀腺功能減退和初期（甲狀腺）、二期（垂體）和三期（下丘腦）甲狀腺功能減退患者的治療。L-T450%～80%是通過胃腸道吸收，空腹口服后，達(dá)峰時(shí)間為6 h，之后血漿L-T4濃度不斷下降。由于L-T4較之三碘甲腺原氨酸（T3），與蛋白結(jié)合率更高，結(jié)合更牢固，故一般3～5 d才起作用。大多L-T4代謝發(fā)生在周圍器官，經(jīng)過在肝、腎及其他組織中部分脫碘轉(zhuǎn)化為T3和反三碘甲狀腺原氨酸（rT3）。T4和T3的血漿半衰期分別為6～7 d和1～2 d。L-T4是一個(gè)治療指數(shù)窄的藥物，同時(shí)血液中自然存在少量的L-T4。在本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及生物等效性評價(jià)中，參照了美國食品與藥物管理局（FDA）發(fā)布的關(guān)于以左甲狀腺素鈉為例的體內(nèi)藥動學(xué)、生物利用度研究和體外溶出試驗(yàn)指導(dǎo)原則[1]，以便保證這類窄治療窗藥物的生物等效的確與治療學(xué)上的等效是一致的。德國柏林化學(xué)股份有限公司生產(chǎn)的L-T4（商品名:雷替斯?）已在中國上市，由于某些患者不耐受乳糖或?qū)χ珓┻^敏，該公司研制出Berlthyrox?，該片劑不含乳糖和著色劑，已在德國上市，為申請?jiān)谥袊M(jìn)口注冊，現(xiàn)以雷替斯?為參比制劑，對Berlthyrox?進(jìn)行人體相對生物利用度研究，以評價(jià)2種制劑是否具有生物等效性，為新藥申報(bào)和臨床合理應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

SN-695B型智能放射免疫γ測量儀（上海核所日環(huán)光電儀器有限公司）；DK-600A型電熱恒溫水箱（上海一恒科技有限公司）；KDC-2044低速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；Vortex genie 2渦旋振蕩器（美國Scientific industries公司）；MODELYB DH-1低恒壓吸引器（上海醫(yī)療器械工業(yè)（集團(tuán)）公司醫(yī)用吸引器廠）；411分液器（瑞士Socorex公司）；DAS 2.0數(shù)據(jù)處理軟件（皖南醫(yī)學(xué)院）。

1.2 試藥

受試制劑:（Berlthyrox?，德國柏林化學(xué)股份有限公司，規(guī)格:每片含L-T4100 μg，不含乳糖，批號:84105）；參比制劑:（雷替斯?，德國柏林化學(xué)股份有限公司，規(guī)格:每片含L-T4100 μg，含乳糖，批號:84034）；T4放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字S10930048，批號:20090920、20091020、20091120）；T3放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字S10930047，批號:20090920、20091020、20091120）；T4、T3質(zhì)控血清（中國藥品生物制品檢定所，批號:1601-0812）；水為注射用水（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者選擇

26名健康志愿者，男女各半，平均年齡（23±2）歲，平均身高（165.2±8.6）cm，平均體重（57.8±7.4）kg。試驗(yàn)前，試驗(yàn)方案和知情同意書經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批同意后，受試者簽署知情同意書，經(jīng)病史詢問，并均進(jìn)行常規(guī)體檢和十二導(dǎo)聯(lián)心電圖、實(shí)驗(yàn)室檢查（血常規(guī)、凝血功能、尿常規(guī)、血生化、病毒學(xué)）、甲狀腺功能全套（T3、fT3、T4、fT4、TSH）檢查，合格者入選為受試者。

2.2 試驗(yàn)方案[1]

26名受試者隨機(jī)分成2組，每組12人，按2×2交叉試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，分別口服參比制劑或受試制劑6片（各含L-T4600 μg），藥物經(jīng)清除35 d后交換給藥。受試者禁食過夜10 h，用240 mL溫開水送服。所有受試者在給藥后1 h內(nèi)禁水，4 h內(nèi)禁食。分別于給藥前0.5、0.25、0 h及給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12、18、24、48 h時(shí)由前臂靜脈采血4 mL，置分離膠離心試管中，靜置30～60 min，離心（4 ℃，3500 r·min－1）5 min，分離血清于－70℃冷凍保存。

2.3 血清樣品處理

按藥盒說明書操作。T4:取樣品或標(biāo)準(zhǔn)品50 μL加入試管中，再依次加入125I-T4200 μL和羊抗-T4抗體100 μL，混勻后37℃水浴孵育45 min，加入T3、T4驢抗羊免疫分離劑500 μL，混勻后室溫放置15 min，于4 ℃以3500 r·min－1離心15 min，吸棄上清液，沉淀物用SN-695B型智能放射免疫γ測量儀測定。T3:取樣品或標(biāo)準(zhǔn)品50 μL加入試管中，再依次加入125I-T3200 μL和羊抗-T3抗體100 μL，混勻后37℃水浴孵育1 h，加入T3、T4驢抗羊免疫分離劑500 μL，同上離心、測定。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和分析樣品時(shí)均采用雙復(fù)管。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密移取水500 μL分別溶解T4標(biāo)準(zhǔn)品滅菌粉末，靜置15 min后，渦旋混勻，得到標(biāo)準(zhǔn)血清樣品的濃度分別為20.00、40.00、80.00、160.00、320.00 ng·mL－1，用放射免疫分析法測定各管的放射性每分鐘記數(shù)（counts per minute，cpm），通過logit-log方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得直線回歸方程為:y＝5.3810－1.2099x（r＝－0.99856），線性范圍20.00～320.00 ng·mL－1。另同法溶解T3標(biāo)準(zhǔn)品滅菌粉末，得到標(biāo)準(zhǔn)血清樣品的濃度分別為0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 ng·mL－1，并同法測定，得直線回歸方程為:y＝0.8530－1.0846x（r＝－0.99859），線性范圍0.50～8.00 ng·mL－1。

2.5 方法靈敏度

以20管不含T4、T3的血清的cpm數(shù)的均值－2×標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算方法靈敏度，得T4、T3藥盒靈敏度分別為3.19 ng·mL－1和0.02 ng·mL－1。

2.6 精密度及回收率試驗(yàn)

分別配制T4低、中、高（30.80、77.40、124.00 ng·mL－1）及T3低、中、高（0.81、1.92、3.03 ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控血清樣品，于不同天內(nèi)各測定3批，計(jì)算方法回收率和日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別配制T4低、中、高（30.80、77.40、124.00 ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控血清樣品，分別在室溫放置6 h、反復(fù)凍融（1、2、3次）和－70℃保存58 d條件下測定；另分別配制T3低、中、高（0.81、1.92、3.03 ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控血清樣品，同法測定。結(jié)果RSD均＜15%。

2.8 藥-時(shí)曲線

26名受試者單劑量口服L-T4片受試制劑或參比制劑后T4、T3的平均藥-時(shí)曲線見圖1。

2.9 藥動學(xué)參數(shù)和生物等效性

26名受試者單劑量口服L-T4受試制劑或參比制劑6片后，T4、T3主要藥動學(xué)參數(shù)見表2。

受試者交叉口服2種制劑后，cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析結(jié)果表明，T3制劑、周期、個(gè)體間無顯著性差異，T4制劑、周期、個(gè)體間均有顯著性差異。AUC0～48h經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析結(jié)果表明，除T3制劑周期間無顯著性差異外，其余均有顯著性差異。按生物等效性判定標(biāo)準(zhǔn)，AUC0～48h和cmax90%置信區(qū)間均在80%～125%內(nèi)，認(rèn)為2種制劑生物等效。與參比制劑相比，受試制劑T4的相對生物利用度為（95.9±11.6）%，T3的相對生物利用度為（99.2±12.6）%，表明2種制劑生物等效。tmax經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。T4和T3生物等效性分析結(jié)果見表3。

3 討論

文獻(xiàn)[2]的等效性判定標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換的受試制劑的AUC0～48h在參比制劑的80%～125%范圍內(nèi)，受試制劑的cmax在參比制劑的70%～143%范圍內(nèi)[2]。由于L-T4是一個(gè)治療窗窄的藥物，為了嚴(yán)格增加治療學(xué)上等效性和可替代性，筆者采用了美國FDA等效性判定標(biāo)準(zhǔn)，即受試制劑的AUC0～48h、cmax與參比制劑AUC0～48h、cmax的比值的90%置信區(qū)間在80%～125%范圍內(nèi)[1]。

表2 26名受試者單劑量口服L-T4片受試制劑或參比制劑6片后的T4和T3藥動學(xué)參數(shù)Tab 2 Pharmacokinetic parameters of levothyroxine sodium in 26 healthy volunteers for T4 and T3 after oral administration of Levothyroxine sodium tablets

表3 T4和T3生物等效性分析結(jié)果Tab 3 Results of bioequivalence analysis for T4 and T3

26位受試者（男、女各半）單劑量、隨機(jī)、開放、雙周期交叉口服L-T4片受試制劑和參比制劑后，血清中T4呈明顯時(shí)量變化，受試制劑和參比制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)均與國內(nèi)、外文獻(xiàn)報(bào)道[3～5]基本一致。血清中T3無明顯時(shí)量變化。血清中T4、T3的AUC0～48h、cmax90%置信區(qū)間均在80%～125%范圍內(nèi)。表明2種制劑生物等效。

受試者lncmax方差分析結(jié)果表明T3制劑、周期、個(gè)體間無顯著性差異，T4制劑、周期、個(gè)體間均有顯著性差異。lnAUC0～48h方差分析結(jié)果表明，除T3制劑周期間無顯著性差異外，其余均有顯著性差異。推測原因可能如下:每位受試者體內(nèi)不同時(shí)間的甲狀腺激素基線值水平是不同的，由此可能產(chǎn)生給藥后個(gè)體間的顯著性差異。甲狀腺激素基線值水平受機(jī)體各器官、系統(tǒng)之間相互協(xié)調(diào)、相互制約，由此可能產(chǎn)生給藥后周期間和制劑間的差異，提示臨床要注意個(gè)體化給藥。

[1]US Dept of Health and Human Services，F(xiàn)ood and Drug Administration，Center for Drug Evaluation and Reserch.Guidance for Industry:Levothyroxine sodium tablets in vivo pharmacokinetic and bioavailability studies and in vitro dissolution testing[EB/OL].http://www.Fda.gov/cder/guidance/3645fnl.htm.2004-10-07.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局.化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[EB/OL].http://www.doc88.com/p-30190808136.html.2005-03.

[3]朱 立，趙志英，王正華.國產(chǎn)左甲狀腺素鈉片劑生物利用度研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2001，17（6）:440.

[4]榮征星，趙詠桔，陳廣潔，等.左甲狀腺素2種配方片劑人體生物利用度比較[J].中國新藥與臨床雜志，2005，24（1）:7.

[5]Di Girolamo G，Keller GA，de Los Santos AR，et al.Bioequivalence of two levothyroxine tablet formulations without and with mathematical adjustment for basal thyroxine levels in healthy Argentinian volunteers:a single-dose，randomized，open-label，crossover study[J].Clin Ther，2008，30（11）:2015.