固相萃取-HPLC法測定白果中總銀杏酸的含量Δ

羅 曼，鮑家科，宋曉寧，張志勇，張志宇，吳克楠（貴州省藥品檢驗所，貴陽市 550004）

白果為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥成熟種子，秋季種子成熟時采收，除去肉質外種皮，洗凈，稍蒸或略煮后，烘干[1]。白果具有多種生物活性物質，銀杏酸是其毒性成分，具有致敏性、胎盤毒性和免疫毒性作用[2～4]，對人類健康有潛在危害，但現行質量標準中尚未控制白果中銀杏酸的含量。因此，應建立準確的分析方法，對白果及其炮制品中的銀杏酸進行控制，為白果及其炮制品的研究提供理論基礎。

固相萃取（solid-phase extraction，SPE）是近年發展起來的一種樣品預處理技術，由液-固萃取和柱液相色譜技術相結合發展而來，由于具萃取效率高、選擇性好、適用范圍廣、操作簡單、省時等優點，目前已被較為廣泛地應用于環境分析、食品分析、生物樣本中毒物的分析[5，6]中，在復雜中藥有效成分分析方面的應用也日益增加[7～9]。銀杏酸在白果中含量甚微，藥材中又存在大量復雜基質，用傳統的提取分離方法較難有效地從白果中提取銀杏酸。筆者參考2010年版《中國藥典》（一部）銀杏葉提取物總銀杏酸檢查項下方法[1]及有關文獻[10]，采用C18固相萃取小柱對樣品進行純化精制，擬定白果中總銀杏酸的含量測定方法，其準確度與重復性考察均獲得了較滿意的結果，適用于白果中總銀杏酸的含量分析。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜（HPLC）儀、色譜工作站（美國Agilent公司）。

總銀杏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:110770-220510）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；8批市售白果藥材分別來源于貴州貴陽、貴州羅甸、貴州水城、四川都江堰、四川汶川等地，經本所熊慧林主任藥師鑒定為銀杏科植物銀杏G.biloba L.的干燥成熟種子。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相:甲醇-3%冰醋酸（91∶9）；檢測波長:310 nm；柱溫:30 ℃；流速:1.0mL·min-1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取總銀杏酸對照品20.73mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液（0.2073mg·mL-1）。再精密量取5mL此貯備液，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得對照品溶液（0.10365mg·mL-1）。

2.3 供試品溶液的制備

取白果細粉（過三號篩）約2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，精密加入無水甲醇25mL，稱定，80℃水浴中回流3 h，放冷，用無水甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液15mL，80℃水浴揮至近干，用75%甲醇2mL溶解轉移至已處理好的C18固相萃取小柱（先用無水甲醇10mL沖洗，再用75%的甲醇溶液10mL沖洗，小柱上加脫脂棉少許）上，繼續用75%甲醇5mL洗脫，洗脫液棄去。再用無水甲醇約4.5mL洗脫，洗脫液收集于5mL量瓶中，加無水甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

分別精密吸取對照品溶液10μL與供試品溶液10～20μL，注入液相色譜儀測定，按外標法計算，即得。

2.4 專屬性考察

在“2.1”項下色譜條件下，總銀杏酸與其他組分可達到基線分離。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.總銀杏酸對照品；B.供試品Fig 1 HPLC chromatogramsA.ginkgolic acids control；B.test sample

2.5 線性關系考察

分別精密吸取總銀杏酸對照品溶液（0.10365mg·mL-1）6、10、14、20、24 μL（0.6219、1.0365、1.4511、2.0730、2.4876μg），注入液相色譜儀測定，按“2.1”項下色譜條件測定總峰面積。以總峰面積積分值（Y）為縱坐標，總銀杏酸進樣量（X）為橫坐標，制備標準曲線，得回歸方程為Y＝413.2750X－4.2990（r＝0.9999，n＝5）。結果表明，總銀杏酸進樣量在0.6219～2.4876μg范圍內與總峰面積積分值呈良好線性關系。擬合成過原點的直線方程為Y＝410.9284451X。將線性關系考察的最低進樣量與最高進樣量分別代入兩方程進行計算，所得峰面積相對偏差為0.62%（低）～0.0031%（高），由此可作截距近似為0，故本文中采用外標一點法計算總銀杏酸含量。

2.6 精密度試驗

精密吸取總銀杏酸對照品溶液（0.10365mg·mL-1）10 μL，注入液相色譜儀，重復測定5次，按“2.1”項下色譜條件測定總峰面積。結果，RSD＝1.08%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取白果細粉（過三號篩）約2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，共6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取20μL，進樣測定含量。結果，總銀杏酸的平均含量為0.2021mg·g-1，RSD＝1.58（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

取白果細粉（過三號篩）約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于不同時間（0、2、4、6、8、10、12 h）精密吸取 20μL，進樣測定。結果，RSD＝0.74%（n＝7），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已測知含量（0.2021mg·g-1）的樣品約1.3 g，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液（0.2073mg·mL-1）1.3mL，置80 ℃水浴上揮盡溶劑，放冷，自“精密加入甲醇25mL，稱定……”起，按“2.3”項下方法操作，計算加樣回收率，結果見表1。

2.10 耐用性試驗

選擇3種不同品牌色譜柱[Aglient Ecilipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）、Waters Symmetry C18（150mm×4.6mm，5μm）、Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm）]，檢測同一批次

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.11 樣品含量測定

取市售白果藥材8批，依法測定含量，結果見表2。樣品，每一批次平行測定2份。結果，RSD＝1.93%（n＝6），表明色譜柱的改變對測定結果無顯著影響。

表2 樣品含量測定結果Tab 2 Results of content determination of samples

3 討論

白果既含有大量水溶性雜質，又含有較多的親脂性雜質。由于總銀杏酸有一定的脂溶性，筆者曾采用正己烷、石油醚等極性較低的溶劑提取總銀杏酸，硅膠柱精制供試品，但僅有微量銀杏酸檢出，表明方法不適用于白果中銀杏酸的分析。又曾參考文獻以極性較低溶劑石油醚索氏提取樣品，以去除白果中大量極性較大的水溶性雜質，但經試驗發現石油醚的提取效率不高，平行樣品測定結果的偏差較大。考慮到銀杏酸在甲醇中易溶解，本研究采用80℃甲醇回流提取樣品，同時考察了提取時間，以回流3 h的測定值最高，若增加提取時間，含量測定值不再增高，從而確定樣品提取方法為80℃甲醇回流提取3 h。但甲醇提取物含雜質較多，會干擾測定，且損害色譜柱的使用壽命。故本研究采用與液相色譜柱填料相近的C18小柱進行固相萃取，甲醇提取物以75%甲醇溶液洗脫，除去極性較大的雜質，再收集一定體積的甲醇洗脫液，洗脫液中含總銀杏酸，剩余的大量脂性雜質則保留在小柱上，從而有效地除去了雜質的干擾，保證了測定結果的準確性。

筆者考察了不同體積分數的甲醇溶液作洗脫溶劑的效果。結果發現，使用75%甲醇溶液作洗脫劑，收集量為5mL，洗脫液中檢出大量雜質但無總銀杏酸；再收集5mL洗脫液，洗脫液中僅有少量雜質檢出。再以80%甲醇溶液5mL作洗脫劑，洗脫液中有少量總銀杏酸檢出。因此，確定采用75%甲醇溶液5mL作洗脫劑，可洗脫試樣中大量的極性較大雜質，保留于小柱上的總銀杏酸再以約5mL無水甲醇洗脫，獲得了較滿意的結果。

試驗比較了3種不同品牌色譜柱（見“2.10”項），在上述色譜條件下，樣品色譜中總銀杏酸各峰與其他雜質峰均能達到基線分離。3種色譜柱的柱效以總銀杏酸組峰中白果酸C15峰計算均不低于5000，考慮到色譜柱的差異及使用壽命等影響因素，暫定在分離度符合藥典要求的前提下，色譜柱的理論板數按白果酸C15峰計算應不低于3000。

經試驗，發現有部分批次市售白果的總銀杏酸含量超過國際限量標準（200mg·kg-1），且不同來源渠道白果中銀杏酸含量差異較大，這可能與銀杏產地、采收時間、銀杏樹齡及藥材采收后的處理條件等有關。試驗結果提示應對白果的食用安全性引起重視，增加總銀杏酸的質控指標，并對藥材采集后的處理條件參數（如蒸、煮、烘干等環節中的具體溫度、時間、壓力等）作進一步的明確。

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