HPLC法測定甲狀旁腺激素1-34原料藥中有關物質的含量

余邦良，楊柳，王秀玲（1.海南醫學院藥學院，海口市 571101；.海南紫杉園藥業有限公司，海口市 57016）

甲狀旁腺激素1-34用于絕經后女性骨質疏松癥，能增加患者骨密度并降低脊椎與非脊椎骨折的風險[1，2]，而且其作用強于阿侖膦酸鈉[3，4]；同時，其也可以用于提高男性原發性骨質疏松癥或性腺功能減退的骨質疏松癥患者的骨量。該藥治療范圍包括原發性骨質疏松癥、繼發性骨質疏松癥和具有骨質疏松引發骨折病史的患者，或有多種誘發骨折的風險及以往的骨質疏松癥針對性治療方法對其失敗或無法耐受的患者[5，6]。甲狀旁腺激素1-34注射劑作為一種全新的抗骨質疏松藥物，由美國Lilly公司研發成功，并于2002年12月在美國上市，商品名Forteo[7]。但該品種目前在我國沒有上市。由于甲狀旁腺激素1-34是采用固相合成的多肽物質，精制純化后可能會存在相關肽類雜質，而這些雜質的存在會影響藥品的質量，所以需要在原料藥標準中建立其有關物質的檢測項。本文采用高效液相色譜（HPLC）法測定甲狀旁腺激素1-34原料藥中有關物質的含量，并進行了方法學研究。

1 儀器與試藥

Waters 2695型HPLC儀、Waters 2996二極管陣列檢測器、Waters Millennium32色譜工作站（美國Waters公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）。

甲狀旁腺激素1-34對照品（美國Peptide公司，批號:M10029B1，含量:99.7%）；甲狀旁腺激素1-34原料藥（地奧集團成都藥業股份有限公司，批號:100201、100202、100203，含量分別為99.4%、99.3%、98.9%）；乙腈為色譜純，氯化鉀為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18（250mm ×4.6mm，5 μm）；流動相:0.05 mol·L－1氯化鉀水溶液（pH4.5，磷酸調節）-乙腈＝75∶25；流速:1.0mL·min－1；檢測波長:210 nm；柱溫:室溫；進樣量:20μL。

2.2 溶液的制備

供試品溶液:取甲狀旁腺激素1-34原料藥適量加水溶解并稀釋制成每1mL中含甲狀旁腺激素1-341.0mg的溶液，作為供試品溶液。

對照品溶液:取經五氧化二磷干燥至恒重的甲狀旁腺激素1-34對照品適量加水溶解，制備成每1mL中約含甲狀旁腺激素1-341.0mg的溶液，作為對照品溶液。

自身對照溶液:精密量取上述供試品溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統適用性試驗

精密量取供試品溶液20μL，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜。在上述色譜條件下，理論板數以甲狀旁腺激素1-34計在2000以上。甲狀旁腺激素1-34與相鄰雜質峰的分離度≥1.5。

2.4 專屬性試驗

2.4.1 酸破壞樣品溶液:精密稱取甲狀旁腺激素1-34原料藥適量，加6 mol·L－1的鹽酸溶液2mL，使其溶解后，放置在水浴中加熱30min，放冷，用1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調至中性后，用水稀釋成每1mL中約含1.0mg的甲狀旁腺激素1-34溶液。

2.4.2 堿破壞樣品溶液:精密稱取甲狀旁腺激素1-34原料藥適量，加1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液2mL，使其溶解后，放置在水浴中加熱1 h，放冷，用1 mol·L－1鹽酸溶液調至中性后，用水稀釋成每1mL中約含1.0mg的甲狀旁腺激素1-34溶液。

2.4.3 氧化破壞樣品溶液:精密稱取甲狀旁腺激素1-34原料藥適量，加3%的過氧化氫溶液2mL，溶解后，用水稀釋成每1mL中約含1.0mg的甲狀旁腺激素1-34溶液。

2.4.4 光破壞樣品溶液:取甲狀旁腺激素1-34原料藥，置于4000 lx的燈光下照射48 h，精密稱取適量，用水稀釋成每1mL中約含1.0mg的甲狀旁腺激素1-34溶液。

2.4.5 高溫破壞樣品溶液:取甲狀旁腺激素1-34原料藥，置于130℃環境中放置2 h，冷卻，精密稱取適量，用水稀釋成每1mL中約含1.0mg的甲狀旁腺激素1-34溶液。

精密量取上述各種破壞溶液20μL進樣測定，記錄色譜。結果，經酸、堿、氧化、光和高溫破壞后的供試品溶液的色譜中均有不同程度的雜質峰產生，且均與主成分峰分離良好，因此該色譜條件滿足有關物質檢查的系統適用性要求。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.酸破壞樣品；D.堿破壞樣品；E.氧化破壞樣品；F.光破壞樣品；G.高溫破壞樣品；1.甲狀旁腺激素1-34；2、3、4.雜質Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.sample destroyed by acid；D.sample destroyed by base；E.sample destroyed by oxidation；F.sample destroyed by light；G.sample destroyed by high temperature；1.PTH 1-34；2，3，4.impurities

2.5 峰純度檢查

分別取“2.4”項下的5種破壞溶液各20μL進樣測定，經二極管陣列檢測器檢測，其主成分峰的純度為999.996（閾值為950），表明主成分峰未包含其他雜質峰。

2.6 最小檢出量的確定

取甲狀旁腺激素1-34對照品適量，用水溶解并稀釋至每1mL中含25 ng的溶液，精密量取該溶液20μL注入液相色譜儀測定，記錄色譜。結果S/N＝3，最小檢出量為0.5 ng。

2.7 線性關系考察

由于甲狀旁腺激素1-34有關物質的對照品不易獲得，在假設主成分與各雜質的影響因子均相同的前提下，考察雜質量在自身對照溶液濃度附近變化時的線性規律[8]。吸取對照品溶液0.5、1、2、3、4、5mL分別置于100mL容量瓶中用水稀釋定容。精密吸取上述不同濃度的溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜，測定峰面積。以進樣濃度（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程:Y＝1.517×104X－5.158×102（r＝0.99996）。結果表明，甲狀旁腺激素1-34有關物質檢測濃度線性范圍為5～50μg·mL－1，即雜質量在該濃度范圍內變化時，用自身對照溶液進行定量，能夠得到比較準確的結果[9]。

2.8 穩定性試驗

取“2.2”項下供試品溶液于室溫下放置，分別于0、2、4、6、12 h進樣20μL分析。結果，供試品溶液的主成分峰及雜質峰的峰面積均基本一致，RSD＝0.49%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.9 樣品中有關物質的含量測定

取3批樣品，按“2.2”項下方法制備供試品和自身對照溶液；精密量取自身對照溶液20μL，注入液相色譜儀，調節儀器靈敏度，使主峰高為滿量程的20%；再精密量取供試品溶液和自身對照溶液各20μL進樣，記錄色譜至主成分峰保留時間的4倍。按主成分自身對照法以峰面積計算雜質的量。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，各雜質峰的面積之和不得大于自身對照溶液主峰面積。結果，3批樣品中有關物質含量均小于0.29%，詳見表1。

表1 3批樣品中有關物質檢測結果Tab 1 Results of content determination of the related substances in 3 batches of samples

3 討論

3.1 波長的選擇

對甲狀旁腺激素1-34對照品溶液于二極管陣列檢測器上200～400 nm波長范圍內掃描，結果顯示甲狀旁腺激素1-34在210、280 nm波長處均有吸收峰。因此，將檢測波長分別設為210、280 nm時進行色譜比較，結果顯示在這2個波長下雜質的種類和含量沒有明顯變化。但根據文獻[10]報道，多肽類樣品的檢測波長多采用210或214 nm，故選擇測定波長為210 nm。

3.2 流動相的選擇

3.2.1 流動相組成的影響:廖海明等[11]采用流動相A（水-乙腈-三氟乙酸＝990∶10∶1）、流動相B（水-乙腈-三氟乙酸＝10∶990∶1），梯度洗脫，在215 nm波長處測定甲狀旁腺激素1-34的含量；梁成罡等[12]采用流動相A（0.1%三氟乙酸水溶液）、流動相B（含0.1%三氟乙酸的乙腈-水＝95∶5），梯度洗脫，在214 nm波長處測定甲狀旁腺激素1-34的含量。但這2種方法所使用的流動相pH值實際上小于2，超過一般反相色譜柱的pH使用范圍（2～8）[13，14]，易導致硅膠相連的化學鍵合相水解脫落[14]，因而對色譜柱損害較大；同時這2種方法采用梯度洗脫，對色譜柱要求較高；所需洗脫時間相對長，前者主峰出峰時間為15min左右，根據要求測定有關物質的全程洗脫時間達60min，而后者主峰出峰時間為25min左右，根據要求測定有關物質的全程洗脫時間達100min。為此，筆者在水相中加入氯化鉀，并用磷酸調節pH值，等度洗脫，大大縮短了分析時間，而且能滿足系統適用性要求，因此用此流動相進行試驗。

3.2.2 流動相pH的影響:甲狀旁腺激素1-34對酸較穩定，對堿不穩定[12]，筆者將流動相中0.05 mol·L－1氯化鉀水溶液的pH值用磷酸分別調至2.0、4.5、6.0，考察其色譜行為，結果pH值在4.5時拖尾因子最小，分離效果最好。

3.2.3 流動相中有機溶劑濃度的影響:乙腈量為10%時，主峰保留時間較長，這樣不僅浪費時間，而且也浪費昂貴的有機流動相；而乙腈量增加到40%時，主峰保留時間太短，主峰理論板數達不到要求，且與雜質的分離不符合要求；當乙腈量為25%時，保留時間適中，主峰理論板數符合要求，與雜質的分離也符合要求。故確定水相與乙腈相比例為75∶25。

綜上所述，所建立的方法簡便、準確、靈敏度高、專屬性強，可用于甲狀旁腺激素1-34原料藥中有關物質的含量測定。

[1]Anastasilakis AD，Goulis DG，Polyzos SA，et al.Headto-head comparison of risedronate vs.teriparatide on bone turnover markers in women with postmenopausal osteoporosis:a randomized trial[J].Int J Clin Pract，2008，62（6）:919.

[2]宋慶明，盛正妍，劉皋林.特立帕肽治療骨質疏松癥的應用進展[J].國際藥學研究雜志，2008，35（6）:415.

[3]Keaveny TM，Donley DW，Hoffmann PF，et al.Effects of teriparatide and alendronate on vertebral strength as assessed by finite element modeling of QCT scans in women with osteoporosis[J].J Boneminer Res，2007，22（1）:149.

[4]Clung MR，San Martin J，Miller PD，et al.Opposite bone remodeling effects of teriparatide and alendronate in increasing bone mass[J].Arch Intern Med，2005，165（15）:1762.

[5]Kaufman JM，Orwoll E，Goemaere S，et al.Teriparatide effects on vertebral fractures and bonemineral density in men with osteoporosis treatment and discontinuation of therapy[J].Osteoporos Int，2005，16（5）:510.

[6]Saag KG，Shane E，Boonen S，et al.Teriparatide or alendronatein glucocorticoid-induced osteoporosis[J].N Engl J Med，2007，357（20）:2028.

[7]李曉東.骨質疏松治療藥特立帕肽[J].世界臨床藥物，2005，26（9）:572.

[8]田 蘭，趙秀紅，封淑華，等.HPLC法測定甲氧氯普胺中有關物質的含量[J].中國藥房，2009，20（13）:1008.

[9]許晉星.RP-HPLC法測定馬來酸桂哌齊特片中有關物質的含量[J].中國藥房，2009，20（1）:59.

[10]Kamp RM，Choli-Papadopoulou T著.施蘊渝，饒子和譯.蛋白質結構分析:制備、鑒定和微量測序[M].北京:科學出版社，2002:50.

[11]廖海明，曾文珊，楊仲元，等.HPLC法測定重組人甲狀旁腺激素1-34肽含量及有關物質[J].藥物分析雜志，2006，26（1）:27.

[12]梁成罡，李克堅，張 慧，等.重組人甲狀旁腺激素的質量研究[J].藥物分析雜志，2005，25（2）:215.

[13]李發美.分析化學[M].北京:人民衛生出版社，2007:393.

[14]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄29.