抑肝散抗小鼠腦缺血/再灌注損傷的作用研究(Ⅰ)

王 敏，傅 強，馬占強，馬世平

中國藥科大學中藥藥理教研室，南京 211198

缺血性腦血管病是一種常見病和多發病，是目前嚴重危害人類健康與生命的主要疾病之一，因具高發病率、高死亡率、高致殘率和高復發率等特點而引起國內外醫學界的廣泛關注與高度重視[1]。抑肝散出自于《保纓撮要》，由當歸、鉤藤、茯苓、白術、川芎、柴胡及甘草等組成，主治神經癥、不眠癥、小兒夜啼等。近年來，中日兩國學者應用該方治療血管性癡呆、急性缺血性腦病和中風后遺癥，療效顯著[2-4]。本文用小鼠缺血再灌注模型模擬人類腦梗死，觀察抑肝散對腦缺血的保護作用。

1 材料與方法

1.1藥品和試劑

抑肝散方中各藥材均購于南京市金陵大藥房并經本校秦民堅教授鑒定：當歸為Angelica sinensis(Oliv.)Diels的根，鉤藤為Unearia rhynchophy lia(Miq.)Jacks的干燥帶鉤莖枝，川芎為Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，白術為Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，茯苓為Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，柴胡為 Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，甘草為Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖。實驗時按原方比例稱取藥材，常規水煎煮，濃縮，用時加蒸餾水配成所需濃度。實驗中所用劑量均按生藥量計算。

尼莫地平(Nimodipine，Nim)，天津市中央藥業有限公司產品，批號:090502；無水乙醇，南京化學試劑廠產品，批號:080110046；水合氯醛，中國醫藥(集團)上海化學試劑公司，批號:20080610；2,3,5-三苯基氯化四氮唑，批號:20100423，Amresco。除尼莫地平之外，以上均為分析純。一氧化氮、一氧化氮合酶（NOS）試劑盒（批號:20100303、20100323）；考馬斯亮蘭測定試劑盒（批號:20091214），以上購于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器

HH-4數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；純水機(Hi-tech Instruments Co.Ltd)；電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；臺式高速冷凍離心機(Sigma，美國)；DG3022A型酶級聯反應檢測儀(Thermo Electron 公司，美國)；恒溫干燥箱（Ecocell，德國）；Kubota 5800離心機（久保田公司，日本）。

1.3 動物

SPF級ICR雄性小鼠，江蘇省南京市青龍山動物養殖場提供，許可證號SCXK(蘇)2007.0001，體重18～22 g，動物分籠飼養，保持12 h晝夜節律，室溫(22±1)℃，自由飲水攝食。

1.4 分組、給藥及造模

分組及給藥：小鼠隨機分為6組，每組8只。假手術組(正常組)；模型組；尼莫地平組(0.6 mg·kg-1)；抑肝散低(3 g·kg-1)、中(6 g·kg-1)、高(12 g·kg-1)劑量組。給藥7 d末次給藥1 h后手術，模型組及假手術組灌胃相同容積水。

局灶性腦缺血/再灌注模型的制備[5]：將小鼠用4%水合氯醛(350 mg·kg-1)麻醉后，仰臥固定在手術臺上，常規消毒，頸正中切口，分離暴露右側頸部血管，將頸外動脈(ECA)、頸總動脈(CCA)結扎，頸內動脈(ICA)輕微系扎。在頸總動脈上做一切口，將制作好的魚線插入頸內動脈，繼續進線直到略感阻力為止。此時，魚線前端已經阻斷大腦中動脈(MCA)起始段及其所有血液供應，造成 MCA局灶性缺血，縫合皮膚。經過1 h的梗塞后，輕輕地將魚線拉出 MCA起始段，進行再灌注，放回籠中保溫飼養,1 h后進行神經功能評分。假手術組的麻醉及手術過程與模型組相同，但不阻斷頸總動脈，觀察時間與模型組相同。在全部造模過程中保持動物肛溫在37℃左右。

1.5 神經功能缺陷評分

整個評分采用單盲法，即評分者不知道實驗動物分組情況。采用Longa[6]的5分評分標準：0分為無癥狀；1分為不能完全伸展對側前爪；2分為向對側轉圈；3分為向對側傾倒；4分為不能自行行走，意識喪失。剔除0分、4分和術后死亡動物，滿足1、2、3分的動物均為造模成功。

1.6 腦含水量、腦指數及腦梗死率的測定[7]

小鼠腦缺血再灌注24 h后斷頭取腦，去小腦及延腦。稱重(濕腦重)，計算腦指數(腦指數=濕腦重×100/體重)。然后在110℃烤箱中烤至恒重，分析天平稱重(干腦重)，計算腦含水量，腦含水量（%）=(濕腦重-干腦重)/濕腦重×100%。

另一部分小鼠腦去除嗅腦、小腦和低位腦干，取左側大腦半球沿冠狀面切成5片，進行TTC染色，置37℃溫育10 min后，正常組織呈紅色，梗死組織呈白色。小心挖取并稱重白色組織，以梗塞組織重量占全腦重量百分比為腦梗死率。

1.7 組織病理檢查

小鼠腦缺血再灌注24 h后斷頭取腦，去小腦及延腦。在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干。甲醛固定，冠狀面切為三部分，常規包埋，各組取相同部位制成連續切片。切片厚5 μm，HE染色，光學顯微鏡觀察。

1.8 腦組織中NO、總NOS、iNOS含量的測定

小鼠斷頭取腦，去除嗅腦、腦干、小腦后將大腦分別置于勻漿器中，用冰生理鹽水按質量與體積為1∶9的比例，冰浴下制備成體積分數為10%的腦組織勻漿,2500 r·min-1，離心 15 min，取上清液備用。按照試劑盒說明書測定腦組織中NO、總NOS、iNOS含量。蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.9 統計學處理

2 實驗結果

2.1 抑肝散對腦缺血/再灌注小鼠神經功能缺陷評分的影響

腦缺血再灌注1 h后,除正常組之外所有實驗動物均出現了不同程度的神經運動功能障礙，抑肝散各劑量組動物的神經功能缺陷評分均呈下降趨勢，肌力明顯增加，中、高劑量組與模型組比較，差異有統計學意義，結果見表 1。

2.2 抑肝散對腦缺血再灌注小鼠腦梗死率的影響

小鼠缺血再灌注后經TTC染色后，假手術組腦片全紅；模型組小鼠缺血側額、頂葉皮質及紋狀體可見明顯的白色梗死灶，其梗死率為21.45%；抑肝散低、中、高各劑量組小鼠腦梗死率明顯降低，與模型組比較差異有統計學意義。結果見表1。

表1 抑肝散對腦缺血/再灌注小鼠在神經功能缺陷評分和梗死率的影響(±s，n=8)

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

2.3 抑肝散對腦缺血/再灌注小鼠腦組織病理改變的影響

HE染色后可見模型組大腦皮層灰質細胞層次紊亂，大部分神經細胞受壓，體積縮小，細胞質和細胞核固縮，核染色深(神經細胞萎縮)，細胞及毛細血管間隙明顯增寬，小動脈擴張充血，間質明顯水腫，呈網格狀，與正常組有明顯的形態差異；而抑肝散中、高劑量組和陽性藥組可以明顯改善由腦缺血引起的病理學改變。結果見圖1。

圖1 抑肝散對小鼠腦缺血/再灌注的腦細胞病理學改變

2.4 抑肝散對腦缺血/再灌注小鼠腦含水量和腦指數的影響

實驗表明，模型組腦含水量及腦指數與假手術對照組比較均明顯增加。而抑肝散中、高劑量組和尼莫地平組能明顯降低腦含水量，抑肝散中、高劑量組及尼莫地平組腦指數較模型組明顯降低。見表2。

表2 抑肝散對腦缺血/再灌注小鼠腦含水量和腦指數的影響(±s，n=8)

表2 抑肝散對腦缺血/再灌注小鼠腦含水量和腦指數的影響(±s，n=8)

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs模型組

組別

2.5 抑肝散對腦缺血/再灌注小鼠腦內NO、總NOS、iNOS含量的影響

NO、總NOS、iNOS含量測試結果顯示，與正常組相比，模型組的含量有明顯的升高，除抑肝散低劑量組外各給藥組均能明顯降低模型小鼠腦組織中NO、總NOS、iNOS的含量。 見表3。

表3 抑肝散對腦缺血/再灌注小鼠NO、總NOS、iNOS含量的影響(±s，n=8)

表3 抑肝散對腦缺血/再灌注小鼠NO、總NOS、iNOS含量的影響(±s，n=8)

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

3 討 論

缺血性腦血管疾病的發病率、致殘率和病死率均較高，一般以局灶性腦缺血為主，其中大腦中動脈栓塞造成的腦梗死最為多見。本實驗以此為依據，研究抑肝散對小鼠大腦中動脈缺血再灌注模型的影響。結果顯示，抑肝散給藥組小鼠的神經行為學缺陷明顯改善，腦梗死率和腦含水量明顯降低。腦組織病理學檢查表明，抑肝散可顯著改善因缺血再灌注引起的神經細胞萎縮、細胞及毛細血管間隙的增寬和小動脈的擴張充血，表明抑肝散對小鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

缺血再灌注損傷發病機制中，NO具有非常復雜的雙重作用,在腦缺血早期，NO的產生具有神經保護作用，松弛血管平滑肌，抑制血小板和白細胞的聚集與粘附，調節腦血流量，參與學習記憶過程[8]。隨著缺血時間的延長，尤其是進入再灌注期，由于能量代謝衰竭，可致離子泵功能障礙，興奮性氨基酸釋放大量鈣離子內流，產生大量的NO，過量的NO可通過激活鳥苷酸環化酶而使cGMP水平升高、擴張腦血管、增加腦水腫，高濃度NO可抑制各種線粒體電荷傳遞系統的酶，抑制細胞呼吸和能量代謝，并且通過氧化應激反應生成大量活性氧物質和過氧亞硝酸鹽，引起內皮細胞損傷壞死，脂質過氧化，導致高蛋白水腫液的滲出和表面活性物質的失活，從而造成不可逆神經元細胞的損傷。NOS是NO合成過程中重要的限速因素，體內NO的生物作用完全依賴NOS的活性。因此，測定NOS是研究NO生理病理作用的重要環節，目前已經確定的NOS亞型主要有神經元型NOS(nNOS)、內皮型NOS(eNOS)和誘生型NOS(iNOS)[9-10]。本實驗發現在腦缺血1 h再灌注24 h后腦組織NO、總NOS、iNOS含量顯著升高，抑肝散能明顯降低這3種物質的含量，從而減輕NO的神經細胞毒性，有效減輕缺血再灌注損傷。

本實驗結果提示，抑肝散可能通過降低NO的神經毒性而對缺血再灌注腦損傷發揮保護作用,但缺血再灌注腦損傷的發生機制復雜,各種因素間可能相互促進、相互影響。 抑肝散究竟是通過直接還是間接途徑降低NO的神經毒性,值得進一步探討。

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