18F-FBEM-NGA的合成及結構表征

彭 程,景慧慧,牟甜甜,楊文江,馬云川,張現忠

(1.首都醫科大學宣武醫院 PET中心,北京 100053;2.放射性藥物教育部重點實驗室,北京師范大學 化學學院,北京 100875)

18F是目前PET顯像中使用最多的核素之一,18F標記主要通過親核取代反應實現。首先通過加速器質子輻照18O富集水獲得18F-(比活度約為2.6～21.1 TBq·g-1)。通過親核取代反應可在芳香環、雜環和脂肪鏈上取代氫或離去基團(鹵素、硝基、季銨鹽、磺酸酯基等)直接實現18F標記。生物大分子等對溫度和有機溶劑敏感,一般通過標記合成子(Synthon)或輔助基團(Prosthetic Group)后,利用基團上的反應活性部位與生物大分子上的對應基團在溫和條件下高效鍵合,從而實現放射性核素標記。

隨著PET臨床顯像需要的日益增加,18F標記的肽和蛋白類PET藥物引起了廣泛關注。多肽和蛋白類分子靶向性好,但結構較復雜,含有多個活性位點,對溫度、酸堿度以及有機溶劑等較敏感,直接標記法極易造成多肽和蛋白類分子變性而失去靶向性,需要小分子標記中間體通過選擇性的定位反應進行標記,所得產物放化純度和放化產率都較高[1]。N-琥珀酰亞胺-4-[18F]氟苯甲酸酯(18F-SFB)可以通過與蛋白質或多肽中的賴氨酸殘基反應實現生物分子的18F標記,合成及純化方法簡單、放化產率高,標記產物的體內穩定性較好,是最適宜的18F標記中間體之一[2-4]。但當生物大分子中含有大量賴氨酸殘基時,18F-SFB無法確定標記位點。本工作擬利用18F-SFB與N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽反應生成另一種標記中間體N-2-(4-[18F]氟苯甲酰氨基)乙基馬來酰亞胺(18FFBEM)[5-7]。理論上,18F-FBEM中的馬來酰亞胺雙鍵可以與巰基發生定量反應,可用于標記帶巰基的蛋白質和多肽分子。

研究表明[8-9],去唾液酸糖蛋白(ASGP)受體可以與含有乳糖或半乳糖殘基的分子特異性結合,利用放射性核素標記的含有半乳糖殘基的新乳糖白蛋白類似物對肝功能進行評價。肝受體顯像對于肝臟疾病的早期診斷以及指導治療和預后評價有重要的臨床意義,因此相關研究在我國具有更重要的實際意義。本研究小組與北京協和醫院、解放軍總醫院等密切合作,研制出一系列肝受體顯像劑[8-12]。

本工作擬嘗試用所合成的18F-FBEM對新乳糖白蛋白進行標記,制備得到一種新的18F標記新乳糖白蛋白(18F-FBEM-NGA),并對標記蛋白的性質進行初步評價。

1 主要實驗材料

1.1 主要試劑

18O-H2O:豐度97%,美國劍橋同位素公司產品;K 222(純度≥99%)、N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽(純度≥95%):Fluka公司產品;三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺(97%):Sigma-Aldrich公司產品;叔丁基肼鹽酸鹽(純度為98%):Acros Oganics公司產品;對氟苯甲酸(純度為98%)、N,N'-二環己基碳二亞胺(純度為99%)、O-(N-琥珀酰亞胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、N,N-二異丙基乙胺(純度為99%):Alfa Aesar公司產品。其他試劑均為國產分析純。無水乙腈、無水DMSO均在實驗前進行無水處理并加分子篩,用封口膜密封保存。

1.2 主要儀器

X-6顯微熔點測定儀:北京泰克儀器有限公司產品;Hitachi 260-50紅外光譜儀:日本日立公司產品;FJ-391型同位素活度計:北京核儀器廠產品;Venusil MP-C18柱(5μm,10 mm×250 mm):Agela Technologies Inc.產品;Kromasil C4柱(5μm,4.6 mm×250 mm,30 nm):瑞典Eka Chemicals產品;Model 626 HPLC:美國Alltech公司產品;Shimadu 10AVp高效液相色譜儀:日本島津公司產品;HiTrap脫鹽凝膠柱(Sephadex G25):GE公司提供;RDS 111回旋加速器:德國西門子公司提供。

2 實驗方法

2.1 19 F-FBEM的合成

穩定參考物質19F-FBEM合成路線示于圖1。穩定的19F-SFB按參考文獻[2]合成。用1.05 g對氟苯甲酸、0.86 g N-羥基琥珀酰亞胺和1.55 g N,N'-二環己基碳二亞胺在四氫呋喃(THF)中0～5℃下反應1 h。粗產物經無水乙醇重結晶,得到0.6 g白色針狀晶體,即為19FSFB。計算產率。采用1H NMR、IR對產品結構進行鑒定。

取 84.3 mg19F-SFB、50 mg N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽和1 mL N,N-二異丙基乙胺在乙腈中40℃下反應20 min。反應結束后在40℃下旋干溶劑,粗產物經柱層析分離純化,洗脫劑為V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=50∶1,得到淺黃色粉末,即為19F-FBEM。采用1H NMR、ESI-MS對產品結構進行鑒定。

2.2 18 F-FBEM的合成

18F-FBEM合成路線示于圖2。

圖1 19 F-FBEM的合成路線

圖2 18 F-FBEM的合成路線

18F-的獲得:采用RDS111回旋加速器通過18O(p,n)18F核反應(11 MeV,30μA的質子束流連續轟擊靶60 min)制得約22.2 GBq18F-,并用4-(4-甲基哌啶)吡啶陰離子交換樹脂(QMA分離柱)捕獲純化。

18F-FBEM的合成方法如下 。

(1)用 1 mL K 222的乙腈溶液(含 14 mg K222)和 0.5 mL K 2CO3水溶液(含 3 mg K2CO3)將18F-淋洗到反應瓶中。120℃下用氮氣吹干。

(2)反應瓶中加入1 mL標記前體 RNOTf(4 mg,11μmol)的DMSO溶液,120℃下反應20 min。

(3)再加入0.5 mL 0.2 mol·L-1的NaOH溶液,120℃下反應10 min。反應液用水冷卻后,加入0.5 mL 1 mol·L-1鹽酸。

(4)將反應液用水稀釋至約10 mL,通過活化的Sep-Pak C18柱,之后先用10 mL二次水淋洗,用氮氣吹干,然后用3 mL加1%TFA的乙腈洗脫,得到18F-FB。

(5)向18F-FB中加入30μL 40%Bu4NOH,120℃下用氮氣吹干。加入17 mg TSTU(溶于1 mL無水乙腈),80～100℃下反應5 min。加入500μL 5%醋酸溶液稀釋。

(6)將上述溶液用水稀釋至約10 mL,通過活化的Sep-Pak C18柱,先用10 mL二次水淋洗,用氮氣吹干,然后用2.5 mL二氯甲烷洗脫。50～60℃下用氮氣吹干二氯甲烷,再加入少量乙腈,120℃下用氮氣吹干,得到18F-SFB。測量產品的活度,計算放化產率。采用HPLC分析產品,與穩定參考物質比較并測定放化純度。

(7)將1 mg N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽溶于800μL無水乙腈后加入含有18FSFB的反應瓶中,再加入20μL N,N-二異丙基乙胺。40℃下反應20 min,旋干乙腈,然后加入50μL三氟乙酸,得到18F-FBEM。

(8)用 600μL水稀釋18F-FBEM,用 HPLC對其進行分離純化。加水將洗脫液稀釋至20 mL,通過活化的Sep-Pak C18柱,先用10 mL二次水淋洗,用氮氣吹干,后用3 mL乙腈洗脫,得到18F-FBEM。測量產品的活度,計算放化產率。采用HPLC分析產品,與穩定參考物質比較,并測定放化純度。

2.3 18 F-FBEM-NGA的合成

2.3.1 NGA(新乳糖白蛋白)的預處理

根據文獻[8-10]方法制備并預處理NGA。用含 10 mmol·L-1酒石酸鉀鈉、40 mmol·L-1鄰苯二甲酸氫鉀的溶液稀釋0.5 mol·L-1SnCl2·2H 2O的鹽酸(1 mol·L-1)溶液100倍,再用1 mol·L-1NaOH 調p H 至5.4。取出300μL該亞錫溶液加入100μL(2 mg)NGA中,此時SnCl2·2H2 O約過量 500倍,密封,室溫保存21 h后進行標記。

2.3.218F-FBEM-NGA的合成

18F-FBEM-NGA的合成路線示于圖3。將HiTrap脫鹽凝膠柱(Sephadex G25)用25 mL淋洗液(0.05 mol/L p H 7.5的磷酸緩沖液)平衡,控制流速在1～10 mL/min。將0.5 mL還原好的NGA用1 mL注射器上樣,先用1 mL淋洗液淋洗后,收集1 mL淋洗液,得到除去雜質的還原NGA溶液,回收率＞95%。

圖3 18 F-FBEM-NGA的合成路線

取處理好的NGA溶液250μL溶解18FFBEM,轉移到1.5 mL小離心管中。將1 mg三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP·HCl)溶于100μL PBS(pH 7.4)后加入該反應液中。用0.2 mol·L-1的NaOH 溶液調節 p H 至 7.0～7.5。室溫反應20 min。

將HiTrap脫鹽凝膠柱(Sephadex G25)用25 mL淋洗液(0.05 mol/L pH 7.5的磷酸緩沖液)平衡,控制流速在 1～10 mL/min。將0.25 mL標記好的18F-FBEM-NGA用 1 mL注射器上樣,先用1 mL淋洗液淋洗后,收集1 mL淋洗液,得到除去雜質的18F-FBEM-NGA溶液,回收率＞95%。測量活度,計算放化產率。HPLC分析并計算放化純度。

2.4 18F-FBEM-NGA的體外穩定性

將經過凝膠柱純化的18F-FBEM-NGA在室溫下磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)中放置3.5 h,用HPLC分析其放化純度。

3 結果與討論

3.1 結構表征

3.1.119F-SFB的結構鑒定

19F-SFB的 產 率 為 33.8%。1H NMR(CDCl3):δ:2.919(s,4H,-CH2-CH2-),7.201(t,2H,Ar-H),8.175(m,2H,Ar-H)。IR(KBr)/cm-1:ν(OH):3491,ν(-CO-O-C):1 775、1 730。結果表明,合成產物為目標產物19F-SFB。

3.1.219F-FBEM的結構鑒定

1H NMR(CDCl3):δ:3.660(d,2H,NHCH2),3.838(d,2H,N-CH 2),6.652(s,1H,NH),6.754(s,2H,H-C=C-H),7.114(t,2H,Ar-H),7.776(t,2H,Ar-H)。IR(KBr)/cm-1:ν(NH):3 347,ν(C=O):1 706,1 625。ESI-MS:C13 H 11 FN 2O3,m/z:263.3([M+H]+),與理論值262.08基本一致。以上結果表明,合成產物為目的產物19F-FBEM。

3.2 18 F-FBEM的放化產率及放化純度

18F-SFB和18F-FBEM的HPLC分析結果示于圖4(所用HPLC的參數條件:Alltech高效液相色譜儀和Venusil MP-C18半制備柱;分析條件為:A相:水;B相:甲醇;流速:5 mL/min;淋洗梯度:0～5 min:5%B;5～8 min:5%B→40%B;8～25 min:40%B →90%B)。由圖4可見,18F-SFB的放射性計數峰的保留時間為18.7 min,與標準品19F-SFB的紫外吸收峰的保留時間18.6 min吻合,說明18F-SFB標記成功;18F-FBEM的保留時間為16.7 min,與標準品19F-FBEM的紫外吸收峰的保留時間16.6min相吻合,表明18F-FBEM標記成功。

18F-SFB衰變校正后的放化產率為47.9%。由18F-SFB制得18F-FBEM的反應經衰變校正后的放化產率為20.5%。總放化產率約為9.8%。放化純度大于98%。

3.3 18 F-FBEM-NGA放化產率及放化純度

由18F-FBEM標記NGA得到18F-FBEMNGA的反應經過衰變校正后的放化產率為15.9%,放化純度大于98%。

有關18F-FBEM-NGA合成的HPLC分析結果示于圖 5(所用 HPLC的參數條件:Shimadu 10AVp高效液相色譜儀和 Kromasil C4柱;分析條件為:A相:水(含0.1%TFA);B相:乙腈(含0.1%TFA);流速:1 mL/min;淋洗梯度:0～30 min:30% →70%B)。由圖 5可知,18F-FBEM-NGA的保留時間為14.6 min,18F-FBEM的保留時間為5.7 min,NGA保留時間為14 min,經過放射性標記后,對NGA的HPLC保留時間影響不大,18F-FBEM-NGA的制備獲得成功。

國外報道18F-FBEM標記多肽和蛋白類分子的放射性衰變校正放化產率為 10%～20%(以18F-為起始物計算)[5-7]。本研究的結果與之相比較低,推測原因可能與NGA的預處理方法有關,亞錫對二硫鍵的還原作用可能不夠強,導致與18F-FBEM反應的自由巰基數較少。此外三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽可能會與18F-FBEM反應[6],從而降低18F-FBEM與NGA反應的放化產率。可改用其他還原劑,如DTT(1,4-二硫代蘇糖醇))對NGA進行預處理,避免使用三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽。通過化學手段對蛋白進行處理增加其自由巰基數量,或者蛋白與N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺先反應,增加蛋白中活性氨基數量,再利用18F-SFB進行標記以提高標記率。相關研究工作正在進行中。

3.4 18 F-FBEM-NGA的體外穩定性

18F-FBEM-NGA室溫下放置3.5 h的HPLC分析譜示于圖5d。由圖5d可見,體外放置3.5 h后18F-FBEM-NGA放化純度大于95%,說明18F-FBEM-NGA的體外穩定性較好。

圖4 18 F-FBEM合成的相關HPLC分析譜圖a——19 F-SFB;b——18 F-SFB;c——19F-FBEM;d——18 F-FBEM

4 小 結

本工作合成了18F-FBEM,并嘗試用18FFBEM標記了NGA。18F-FBEM經過放射性衰變校正放化產率為 9.8%,放化純度大于98%。18F-FBEM-NGA經過放射性衰變校正放化產率為15.9%,放化純度大于98%。其在磷酸鹽緩沖液(p H 7.4)中室溫下放置3.5 h后,放化純度仍大于95%,可見18F-FBEM-NGA具有較好的體外穩定性。標記總時間約3.5 h(包括HPLC分離純化時間),自動化合成路線正在設計中。

綜上所述,利用該18F標記輔助基團可以有效進行蛋白類分子的標記,并有可能獲得不同生物性能的標記化合物,作為改善標記化合物性能或獲得新型標記化合物的一種新途徑,值得進一步研究。

圖5 18 F-FBEM-NGA合成的相關HPLC分析譜圖a——NGA;b ——18 F-FBEM-NGA;c——18F-FBEM;d—— 18 F-FBEM-NGA

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