補腎調沖方對去卵巢大鼠性激素水平及下丘腦雌激素受體α、雌激素受體βmRNA表達的影響*

杜永紅，李沛霖，韓 冰

（天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300150）

補腎調沖方對去卵巢大鼠性激素水平及下丘腦雌激素受體α、雌激素受體βmRNA表達的影響*

杜永紅，李沛霖，韓 冰

（天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300150）

[目的]探討補腎調沖方對去卵巢大鼠血清性激素水平及下丘腦雌激素受體α（ERα）、雌激素受體β（ERβ）mRNA表達的影響。[方法]以假手術組為對照，將去卵巢大鼠隨機分為去卵巢空白組，補腎調沖方高、中、低劑量組，已烯雌酚組。采用放射免疫分析法測定血清雌二醇（E2）、促卵泡生成激素（FSH）、促黃體生成激素（LH）水平，采用逆轉錄-聚合酶聯反應（RT－PCR）檢測下丘腦ERα、ERβmRNA表達。[結果]去卵巢大鼠血清FSH、LH水平升高，E2及下丘腦ERα、ERβmRNA水平降低，補腎調沖方大鼠血清E2有升高趨勢，FSH有降低趨勢，補腎調沖方能降低去卵巢大鼠血清LH水平，升高下丘腦ERα、βmRNA的表達。[結論]補腎調沖方在改善去卵巢大鼠性激素水平同時，可能通過影響ERα、ERβmRNA的表達，提高ER的生物效應，從而降低更年期綜合征的發生。

補腎調沖方；去卵巢大鼠；性激素；下丘腦；雌激素受體

更年期綜合征是婦科常見病之一，是指婦女在絕經前后由于卵巢功能逐漸衰退、雌激素水平下降，出現以植物神經系統功能紊亂為主伴有神經心理癥狀的一組證候群。近年來該病有發病年齡提早、發病率上升的趨勢，因而越來越受到人們重視。本實驗選用去卵巢大鼠模型模擬更年期改變，從血清性激素水平及下丘腦雌激素受體（ER）方面探討補腎調沖方的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物與實驗動物環境 雌性Wistar大鼠，體質量（200±10）g(由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供,合格證編號：2002-031)。飼養于天津中醫藥大學動物實驗中心，室溫為（20±2）℃，自由攝食和飲水。在實驗環境中分籠適應性喂養5 d后進行實驗。

1.2 實驗藥品 補腎調沖方，組成：菟絲子15 g，黃精 15g，熟地黃 15g，肉蓯蓉 10g，當歸 10g，川芎 6g，由天津安舜藥房提供。水煎后濃縮定容，相當于原生藥2.4 kg/L的藥物，4℃冰箱保存備用。已烯雌酚片:天津力生制藥廠生產（批號：0501001）。

1.3 主要實驗試劑 雌二醇（E2）放免試劑盒，批號:RG 66-04,購自天津九鼎公司；促卵泡生成激素（FSH）、促黃體生成激素（LH）放免試劑盒，批號：051220，購自北京北方生物技術研究所。ImProm-Ⅱ反轉錄酶、三磷酸脫氧核糖核苷酸（dNTP）、隨機引物pd(N)6購自美國Promega公司；異硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯（DEPC）、β-巰基乙醇等購自美國Simga公司；Taq DNA聚合酶、三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）、水飽和酚、超純水和DNA分子量標準Marker等購自北京鼎國生物技術有限公司；其他生化試劑為國產分析純。

1.4 主要實驗儀器 γ放射免疫計數儀16探頭CAPRIA-16，美國；紫外分光光度計（B ioPhotomete r），德國；臺式高速冷凍離心機（3K18），美國；聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀（TH-48a），杭州大和熱磁有限公司；-80℃超低溫冰箱，美國；多功能電泳儀，北京六一儀器廠；自動凝膠圖像分析系統，上海天能科技公司。

2 實驗方法

2.1 動物模型的建立及分組 在適應環境5 d后，10%水合氯醛，按3mL/kg腹腔注射，將大鼠麻醉成功后，行雙側卵巢切除手術。假手術組按同法操作，僅摘除卵巢周圍部分脂肪。

動物去卵巢1周后連續5 d作陰道細胞學涂片，有動情周期變化者為去卵巢不徹底，予以剔除。假手術組大鼠陰道脫落細胞涂片動情周期正常。

實驗動物按隨機數字表法隨機分為補腎調沖方高、中、低劑量組，已烯雌酚組，去卵巢空白組，假手術組。

2.2 給藥方法 補腎調沖方高、中、低劑量組分別按38.16、19.08、9.54 g/kg體質量（相當于臨床等效劑量4、2、1倍）灌胃。已烯雌酚組:研碎，加水配成混懸液，按0.1mg/kg體質量灌胃。去卵巢空白組：以生理鹽水l0mL/kg體質量灌胃。1次/d，連續60 d。

3 檢測指標與方法

3.1 血清E2、FSH、LH放免測定及方法 末次給藥24 h后股動脈取血。血液靜置40min后，3 500 r/min離心15min，分離血清，置于-20℃低溫冰箱保存待測。采用放射免疫分析法測定，按試劑盒操作。

3.2 下丘腦雌激素受體α（ERα）、雌激素受體β（ERβ）mRNA檢測及方法。

3.2.1 實驗動物取材方法 末次給藥24 h后斷頭處死大鼠，立即取出全腦并在冰浴上分離下丘腦，將組織置于-70℃液氮中保存備用。

3.2.2 檢測基因的引物設計與合成 按照引物設計原則及所需實驗條件，根據Genbank核酸數據庫中的大鼠ERα、ERβ和看家基因G3PDH基因序列設計引物，ERα 引物序列：5′-AATTCTGACAATCGACGCCAG-3′，5′-GTGCTTCAACATTCTCCCTCCTC-3′，擴增片段長度 345 bp；ERβ：5′-TTCCCGGCAGCACCAGTAACC-3′，5′-TCCCTCTTTGCGTTTGGACTA-3′，擴增片段長度260 bp。全部引物由上海生物工程有限公司合成，經聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）純化。

3.2.3 RNA的提取 參照Promega的RNAgents總RNA提取試劑盒，異硫氰酸胍一步法提取，紫外分析儀檢測濃度及純度，λ260/λ280比值在1.7～2.0之間，達到了進行逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）的要求。

3.2.4 逆轉錄反應（RT） 每個反應取2μg總RNA，隨機引物p d（N）62μL和DEPC水，合計11.6μL混合，70℃熱變性10min，迅速冰浴冷卻3min；加入5×ImProm-Ⅱ逆轉錄酶緩沖液4.0μL，ImProm-Ⅱ逆轉錄酶（10U/μL）1.0μL，25m mol/L MgCl22.4μL，dNTP混合物（10m mol/L）1.0μL，混勻，37℃ 90min。

3.2.5 聚合酶反應（PCR） PCR的擴增體系為25μL，其中包括逆轉錄產物2μL，PCR主反應液21μL，上/下游引物（10 μmol/L）1 μL，Taq 酶(1U/μL)1 μL。ERα、ERβPCR 反應條件：94 ℃ 2min，94 ℃ 1min，60℃1min，72℃45秒。

3.2.6 凝膠電泳分析 取PCR產物5μL，2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠（EB）染色，應用GIS-2010凝膠圖像分析系統照相、讀取灰度值并進行分析。

4 數據處理

實驗數據應用SPSS 11.5統計學軟件進行分析。各組數據均以均數±標準差（±s）表示，組間數據比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

5 結果

5.1 血清E2、FSH、LH的測定結果 見表1。

表1 補腎調沖方對去卵巢大鼠血清性激素水平影響（±s，n=8）Tab.1 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the levelsof serum sex hormone in ovariectom ized rats（±s，n=8）

表1 補腎調沖方對去卵巢大鼠血清性激素水平影響（±s，n=8）Tab.1 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the levelsof serum sex hormone in ovariectom ized rats（±s，n=8）

注：與去卵巢空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與乙烯雌酚組比較，○P<0.05。

組別E2（g/L）FSH（IU/L）L H（IU/L）補腎調沖方高劑量組 5.357±2.416△△○ 2.669±0.596△△○ 3.115±0.793*補腎調沖方中劑量組 6.583±1.648△△○ 2.567±0.359△△○ 3.019±0.735*補腎調沖方低劑量組 4.398±1.425△△○ 2.681±0.271△△○ 3.371±0.586△已烯雌酚組 9.468±2.029** 2.116±0.335** 3.062±0.683*去卵巢空白組 4.391±1.558△△ 2.758±0.388△△ 3.982±0.589△△假手術組 11.676±3.994** 1.770±0.448** 2.533±0.826**

結果表明大鼠切除卵巢后，外周血E2水平明顯降低，與假手術組比較有顯著性差異（P＜0.01）；已烯雌酚組大鼠血清E2水平升高，與假手術組比較無顯著性差異（P>0.05）；補腎調沖方組血清E2水平有升高趨勢，與去卵巢空白組比較無顯著性差異（P>0.05）；補腎調沖方組與已烯雌酚組比較有顯著性差異（P<0.05）。

大鼠切除卵巢后，外周血FSH水平升高，與假手術組比較有顯著性差異(P<0.01)；已烯雌酚組大鼠血清FSH水平降低，與假手術空白組比較無顯著性差異（P>0.05）；補腎調沖方組血清FSH水平有降低趨勢，與去卵巢空白組比較無顯著性差異（P>0.05）；補腎調沖方組與已烯雌酚組比較有顯著性差異（P<0.05）。

大鼠切除卵巢后，外周血LH水平升高，與假手術組比較有顯著性差異（P＜0.01）；補腎調沖高、中劑量方組和已烯雌酚組大鼠血清LH水平降低，與假手術組比較無顯著性差異（P>0.05）；補腎調沖方低劑量組和去卵巢空白組比較無顯著性差異（P>0.05）；補腎調沖方組與已烯雌酚組比較無顯著性差異（P>0.05）。

5.2下丘腦ERα、ERβmRNA的測定結果 半定量RT-PCR產物電泳分析見圖 1、2。以管家基因G3PDH為參照，分析ERα、ERβ在各組間的不同表達。

表2 補腎調沖方藥對去卵巢大鼠下丘腦 ERα、ERβm RNA 的影響（±s，n=8）Tab.2 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the ERα,ERβm RNA in the hypothalamus in ovariectom ized rats（±s，n=8）

表2 補腎調沖方藥對去卵巢大鼠下丘腦 ERα、ERβm RNA 的影響（±s，n=8）Tab.2 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the ERα,ERβm RNA in the hypothalamus in ovariectom ized rats（±s，n=8）

注：與去卵巢空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

組別 ERα/G3PDH ERβ/G3PDH補腎調沖方高劑量組 0.714±0.216** 0.870±0.126**補腎調沖方中劑量組 0.783±0.193** 0.887±0.082**補腎調沖方低劑量組 0.325±0.128△△ 0.838±0.084**已烯雌酚組 0.569±0.179** 0.819±0.053**去卵巢空白組 0.220±0.073△△ 0.603±0.138△△假手術組 1.093±0.169** 0.921±0.130**

去卵巢空白組大鼠下丘腦ERαmRNA明顯降低，與假手術組比較有顯著性差異（P<0.01）；補腎調沖方高、中劑量組、已烯雌酚組表達增加，與去卵巢空白組比較有顯著性差異（P<0.01）；補腎調沖方低劑量組與去卵巢空白組比較無顯著性差異（P>0.05），與假手術組比較有顯著性差異（P<0.01）；補腎調沖方高、中劑量組與已烯雌酚組比較無顯著性差異（P>0.05）。

去卵巢空白組大鼠下丘腦ERβmRNA降低，與假手術組比較有顯著性差異（P<0.01）；補腎調沖方組、已烯雌酚組能增加去卵巢大鼠下丘腦ERβmRNA表達，與去卵巢空白組相比較有顯著性差異（P<0.01），與假手術組比較無顯著性差異（P>0.05）；補腎調沖方組與已烯雌酚組比較無顯著性差異（P>0.05）。

6 討論

中醫學認為腎-天癸-沖任對女性生殖機能調節起著重要作用，其中沖任二脈的盛通乃是婦女產生經、孕、產、乳的先決條件，而腎氣的盛衰是決定沖任盛衰的關鍵。絕經前后腎氣漸衰，或受稟賦不足，或房勞多產等因素影響，導致腎臟虛衰，沖任虧損，天癸漸竭，陰精耗傷，陰陽平衡失調，臟腑功能紊亂而出現絕經前后諸癥，故韓冰教授以補腎調沖法作為治療更年期綜合征的基本法則，貫穿于治療始終[1]。補腎調沖方中菟絲子甘、辛，其性平，補而不滯、守而不走，具有補腎養肝，陰陽兩調、精氣并補之功效；黃精甘、平，可“補虛填精”（《滇南本草》），“平補氣血而潤”（《本草從新》）；熟地黃味甘，微溫，“能補腎中元氣”（《本經逢原》），補任脈之陰；肉蓯蓉性味甘溫，具有補腎壯陽、填精補髓、養血潤燥等功效，可以補沖任之氣；當歸甘、辛、溫，可養血滋肝，調經固沖；川芎辛、溫，具活血行氣、調經之功，兩者可調補沖任之氣血。全方具有溫補腎陽、滋養腎陰、調理沖任、養血調經的功效。

下丘腦-垂體-卵巢軸（H-P-O軸）是女性性腺軸，研究表明：卵巢機能衰退較快或比較突然，雌激素水平突然下降或下降迅速，以致植物神經系統不能很好的適應而發生機能紊亂導致更年期綜合征，所以筆者選用去卵巢大鼠作為更年期模型。更年期的機能紊亂伴隨著腦尤其是下丘腦神經元和功能的紊亂[2]。下丘腦是神經內分泌高級整合中樞，同時也接受卵巢分泌的性激素的調控。雌激素的生物學作用由ER介導，在下丘腦ER分布廣泛，尤其是在H-P-O軸上[3]。雌激素受體有α、β兩種亞型，在更年期大鼠下丘腦中ERα、ERβ蛋白表達量明顯下降[4]。ERmRNA的轉錄和翻譯對ER表達起著重要的作用。本研究結果顯示，大鼠去卵巢后，由于血中E2水平下降，解除了對下丘腦和垂體的負反饋調節，導致FSH和LH水平的升高；同時對ER的正相調節作用減弱，使下丘腦ERα、ERβmRNA表達降低。激素補充治療能夠有效緩解更年期癥狀，但因有禁忌證及長期使用存在的潛在風險性，而使臨床應用受到一定局限。韓冰教授在深入研究中醫典籍的基礎上，結合多年臨床實踐，運用補腎調沖方治療更年期綜合征等多種功能失調性卵巢疾病，取得了顯著療效。研究結果顯示補腎調沖方雖未能明顯提高血清E2水平，但可能通過降低LH水平，改善去卵巢大鼠性激素水平，同時上調去卵巢大鼠下丘腦ERα、ERβmRNA 的表達，使 ERα、ERβ 合成增加，從而提高ER的生物效應，降低了更年期綜合征的發生。但是否與通過增強下丘腦芳香化酶催化雄激素轉化為雌激素能力，從而提高了下丘腦局部雌激素的含量有關，有待進一步探討。

[1]孫文墅.韓冰教授補腎調沖法治療婦科疾病經驗[J].天津中醫，1992，9（1）：6-8.

[2]林守清，林 萍，姜玉新，等.絕經后卵巢和子宮萎縮及血雌二醇降低的觀察[J].中華婦產科雜志，1997，32（9）：524－527.

[3]師莉莉，薛曉鷗，姜恩魁.雌激素受體與女性生殖軸關系的研究進展[J].錦州醫學院學報，2004，25（6）：47－49.

[4]紀 中，崔清志，田艷君，等.益坤寧對圍絕經期大鼠下丘腦雌激素受體表達的影響[J].中國比較醫學雜志，2009，19（8）：58－60，80.

Effectsof the Bushen Tiaochong decoction on the levelsof serum sex hormone and the expression levelsof estrogen receptorsα,β m RNA in the hypothalamus in ovariectom ized rats

DUYong-Hong，LIPei-lin，HANBing
（The Second Affiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300150,China）

[Objective]To investigate the effectsof the Bushen Tiaochong decoction on the levelsofserum sex hormone and the expression levels ofestrogen receptorsα,β (ERα,ERβ)mRNA in the hypothalamus in ovariectomized rats.[Methods]Sham operation group wasconsidered ascontrol,castrated ratswere divided into fourgroups:ovariectomized blank group,Bushen Tiaochong decoction high dose group,moderate dose,low dose group,Diethylstilbestrol group.The levels of serum E2,FSH,LH were determraed by radioimmunoassay method,and the RT-PCRmethod wasused to detect the expression levelsof ERα,ERβ mRNA in the hypothalamus.[Results]The levels of serum FSH,LH in ovariectomized ratswas higher aswell as the levels ofestrogenic and ERα,ERβ mRNA in the hypothalamuswas lower.Bushen Tiaochong decoction group on the levelsofserum estrogenic in ovariectomized ratshasa rising trend and the levelsof FSH has a declining trend.Bushen Tiaochong decoction reduced the levels of serum LH and increased the expression levels ofα,βmRNA in the hypothalamus.[Conclusion]Bushen Tiaochong decoction improve the levelsofsex hormones in ovariectomized rats and through increasing the expression levelsofERα,ERβ mRNA to improve ER biologicaleffectsand reduce the occurrence ofmenopausalsyndrome.

Bushen Tiaochong decoction；ovariectomized rats；sex hormone；hypothalamus；estrogen receptor

R692.5

A

1672-1519(2011)03-0240-04

國家自然科學基金項目（81072837）。

杜永紅（1970-），女，博士，主治醫師，研究方向婦科內分泌。

2011-02-03）