胃癌患者血清P53、PCNA抗體的檢測(cè)及意義

劉輝琦 劉 慧 劉 杰 王生蘭 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，青海省西寧市 8000； 西寧市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科

胃癌居消化系腫瘤之首，其發(fā)病率和死亡率近年不斷上升，每年新發(fā)病例及死亡率分別占全部惡性腫瘤的17%和20%［1～3］，嚴(yán)重威脅著人民健康。許多患者在就診時(shí)已經(jīng)到了中晚期，喪失了最佳治療時(shí)機(jī)。因此胃癌的早診、早治是降低其死亡率，提高生存率的主要手段。P53基因的突變、蛋白的表達(dá)及抗體的產(chǎn)生是多種腫瘤包括胃癌發(fā)生中的事件，血清中P53抗體的檢測(cè)在某種程度上可作為腫瘤的輔助診斷及預(yù)后的判定。細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）在胃癌中表達(dá)增加［4］，但血清中是否有PCNA抗體及能否用于胃癌血清學(xué)檢測(cè)尚需進(jìn)行驗(yàn)證。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)胃癌患者血清中P53、PCNA抗體，判斷其在胃癌血清學(xué)診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本。經(jīng)病理診斷為原發(fā)胃癌的患者50例，其中男38例，女12例，年齡36～74歲。健康人50例，男32例，女18例，年齡28～56歲。以上病例均在檢查時(shí)或手術(shù)前、放化療前肘靜脈取血約3ml，非抗凝，待血液充分凝固后2h內(nèi)2 000r／min離心，收集血清，于－80℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑。人P53抗體檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司，人PCNA抗體檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自北京奇松生物科技有限公司。采用 Modern 450BIU－RAD酶標(biāo)儀進(jìn)行比色分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血清PCNA抗體的測(cè)定。待測(cè)血清用標(biāo)本稀釋液1∶5稀釋后每孔內(nèi)加入50μl（每個(gè)樣本做復(fù)孔）。標(biāo)準(zhǔn)品每孔內(nèi)加入50μl（每個(gè)稀釋濃度做復(fù)孔）。37℃溫育120min。棄去液體，甩干。每孔加檢測(cè)溶液 A 100μl，37℃反應(yīng)60min。棄去孔內(nèi)液體，洗板3次，甩干。每孔加檢測(cè)溶液B工作液100μl，37℃反應(yīng)60min。棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，甩干。每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色。每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)。450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值。

1.2.2 血清P53抗體的測(cè)定。待測(cè)血清用標(biāo)本稀釋液1∶5稀釋后每孔內(nèi)加入50μl（每個(gè)樣本做復(fù)孔）。標(biāo)準(zhǔn)品每孔內(nèi)加入50μl（每個(gè)稀釋濃度做復(fù)孔）。37℃溫育30min。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，洗板機(jī)振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)操作4次。每孔加入酶標(biāo)工作液50μl，37℃溫育30min。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，洗板機(jī)振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。每孔先加入顯色劑A液50μl，再 加 入 顯 色 劑 B 液 50μl，混 勻 30s，37℃ 避 光 顯 色15min。每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)，450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0軟件處理，采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

（1）血清PCNA抗體的檢測(cè)：ELISA檢測(cè)正常血清中PCNA抗體濃度為（31.5±2.3）pg／ml，以此確定PCNA蛋白cutoff值為36.1pg／ml。根據(jù)此結(jié)果胃癌組血清中PCNA蛋白陽(yáng)性率高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。（2）血清P53抗體檢測(cè)情況：ELISA檢測(cè)正常血清中P53抗體濃度為（22.3±1.2）pg／ml，以此確定P53抗體cutoff值為24.7pg／ml。根據(jù)此結(jié)果胃癌組血清中P53抗體陽(yáng)性率高于正常對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組血清PCNA抗體、P53抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論

P53基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著非常重要的角色，主要參與細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)，細(xì)胞增殖和凋亡［5，6］。P53基因有野生型和突變型，野生型P53蛋白半衰期短，產(chǎn)生后很快衰減，突變型P53蛋白半衰期延長(zhǎng)，可在腫瘤組織中積累，激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，通過(guò)ELISA法可檢測(cè)血清中P53抗體濃度的變化。增殖細(xì)胞核抗原 （PCNA）是一種僅在增殖細(xì)胞中合成與表達(dá)的多肽，表示細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，是反映細(xì)胞增殖分?jǐn)?shù)和所處周期的客觀指標(biāo)［7］，近年來(lái)已廣泛用于腫瘤細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)研究。PCNA表達(dá)改變發(fā)生在胃黏膜癌變之前，一旦癌變其表達(dá)則升高［8］，因此對(duì)PCNA進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有助于早期發(fā)現(xiàn)胃癌。基因改變是腫瘤的早期事件，其所導(dǎo)致的表達(dá)蛋白的改變可誘導(dǎo)機(jī)體通過(guò)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體而可被檢測(cè)，因此通過(guò)對(duì)胃癌患者血清P53、PCNA抗體的檢測(cè)能夠有助于胃癌的早期診斷。

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