急性大、中強度運動對大鼠骨骼肌p38 MAPK、NF-kappaB活性，IL-6、MRFs mRNA的影響

王今越 丁樹哲 王小虹 胡志剛 范堯

1 佛山大學體育學院（佛山 528000） 2 華東師范大學體育與健康學院 3 東北師范大學體育學院 4 江西師范大學體育學院

運動是骨骼肌重塑主要誘因，肌肉發生是骨骼肌重塑的重要生物學基礎。狹義的肌肉發生僅指胚胎發育過程中，體節細胞經歷增殖、遷移、分化，最終形成肌肉組織的過程；廣義上，肌肉發生還包括成體肌肉干細胞增殖、分化、融合、成熟及肌纖維本身蛋白表達的增強。一直以來，成體肌肉發生機制都是運動學領域的熱點內容。目前對成體肌肉發生的細胞外事件的研究較深入，而對細胞內事件仍知之不多［1］，p38、NF、IL-6在肌肉發生中的作用值得關注。

p38控制多種細胞發生進程［2-4］，肌肉發生亦有其參與。通常認為，p38激活有助肌肉發生，通過特異性抑制劑SB203580抑制p38活性可阻止成肌細胞融入肌管，降低肌肉特異性基因的水平，而通過MKK6的突變激活p38會誘導肌肉分化標志物的表達和多核肌管的形成［5-8］；NFB在不同條件下可能發揮截然相反的作用——對肌肉發生和肌肉降解均有作用［2，8-10］；IL-6是信號轉導研究的新內容，它與糖代謝密切相關，對肌肉發生也有作用，IL-6-/-小鼠衛星細胞的增殖和肌核的增加均被抑制，肌肉發育遲緩［3，4，11］。近年來，C2C12細胞研究顯示，p38激活會上調NF-B活性、IL-6、-actin mRNA含量、MCK依賴性熒光酶活性，而應用NF-B抑制劑BAY11-7085降低了IL-6、-actin mRNA水平及MCK依賴性熒光酶活性，提示p38、NF-B、IL-6三者構成通路調控肌肉發生［4］。成肌因子MRFs（MyoD、MyoG、MRF4、Myf-5）是肌肉發生的主要效應因子，但急性運動誘導下各因子的動力學特征及其功能的異同缺乏深入研究，成肌增強因子MEF2（主要是MEF2c）是MRFs增強因子，其變化應與MRFs有關，而運動對其影響的報道鮮見。

1 材料和方法

1.1 動物分組及運動方案

66只10周齡體重270～300 g的清潔級雄性SD大鼠。飼養環境溫度23℃，濕度40～60%，采用人工燈光模擬自然晝夜變化，光照時間早上8:00至下午5:30。自由進食，國家標準嚙齒類動物常規飼料喂養。所有大鼠正式實驗前5 d均進行3 d適應性跑臺訓練（1次/d、40 min／次、傾角10%、27 m/min），休息2 d，再開始正式實驗。將大鼠隨機均分為11組，具體分為安靜組（C組）、急性大強度運動后0、1、6、16、24 h組（H-0、1、6、16、24 h組，運動方案：1 h、27 m/min、傾角10%，運動30 min后休息5 min，同樣強度再跑25 min）、急性中等強度運動后0、1、6、16、24 h組（M-0、1、6、16、24 h組，運動方案：1h、20 m/min、5%，運動30 min后休息5 min，同樣強度再跑 25 min）。依文獻［12］，27 m/min、傾角 10% 約相當于81 ±3.5%VO2max，跑速20 m/min、傾角5%約相當于 64 ±2% VO2max。

1.2 取材

根據分組，分別在運動后相應時段（0、1、6、16、24 h）以斷頸椎方式分別處死大鼠取腓腸肌，用4℃預冷生理鹽水清洗去除血污，濾紙吸干水分，稱重后切分成數段，錫箔紙包裹，做好標簽，浸入液氮30 min后放入-80℃超低溫冰箱冷凍待測。C組大鼠在處死運動組大鼠當天以同樣方法處死取材并保存。

1.3 主要試劑及試劑盒

p38 MAPK多克隆抗體（小鼠來源，43kD）：Santa Cruz公司；Phospho-p38 MAPK多克隆抗體（Thr 180/Tyr 182、小鼠來源，43kD）：Santa Cruz公司；tubulin多克隆抗體（小鼠來源，50kD）：Cell Signal；Trizol總RNA提取試劑：Tiangen公司；Biort rt-pcr assasy kit：博日公司；NF-B assay kit：KC?生物公司。

1.4 測試方法

1.4.1 Phospho-p38（Thr180/Tyr182）、p38

細胞蛋白提取：取50～100 mg腓腸肌放入小燒杯中，加入1 ml提前預冷的勻漿介質（210 mM甘露醇，70 mM蔗糖，5 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，0.1 mM PMSF，0.5 mM DTT，10 mM NaF）；剪碎肌組織，去除結締組織、脂肪等；電動勻漿，轉速1500 ～ 1800 r/min，使組織勻漿化；勻漿液倒入離心管，1400g 4℃離心10 min；吸取上清即蛋白樣品，BCA法定量。

western blotting 測定 Phospho-p38（Thr180/Tyr182）和p38。一般步驟略。關鍵步驟條件：聚丙烯酰胺凝膠濃度10%；20V穩壓轉移1.5 h；一抗p38、P-p38為1:800、tubulin為1:1000；稀釋，二抗為1:1000。蛋白表達值為條帶的灰度值，以tubulin內參校正。

1.4.2 Phospho-p65（Ser237）、p65

1.4.3 IL-6、MRFs、MEF2c mRNA

按照Trizol Reagent液說明書提取總RNA，檢測總RNA質量和純度采用變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光檢測OD260/OD280比值，依據質量和純度選取符合RT-PCR要求的RNA進行逆轉錄反應。按照Biort RT-PCR kit說明書進行cDNA的逆轉錄，總RNA經RT反應后進行PCR擴增，采用25 μl體系。PCR循環條件 ：（1）95℃ 5 min，（2）95℃30 s，（3）（IL-6：58℃；MYOD：60℃；MyoG：62 ℃；MYF-5：60 ℃；MRF4：60℃；MEF2c：62℃）40 s，（4）72℃ 1 min，（5）回至第 2 步，25個循環 ，（6）72℃ 10 min，（7）保持在 4℃。PCR產物加樣于2%瓊脂糖凝膠、電泳（上樣量12 μl，6×DNA loading buffer 2 μl，電壓 150V，電泳 35 分鐘）。mRNA含量為條帶的OD值，以-actin內參校正。引物見表1，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 PCR引物

1.5 統計學分析

以WB、PCR、ELISA各指標的測試結果除以該指標對照組均數，進行同倍比的標準化處理。實驗數據由SPSS12.0統計軟件處理，計算平均值和標準差（± s），采用獨立樣本t檢驗分析組間差異顯著性，顯著性水平定為0.05。

2 結果

2.1 Phospho-p38和p38

圖1顯示，H-0、1、6 h 及M-0、1、6 h組Phospho-p38 均顯著高于C組（均 P < 0.01），M-0、1、6 h組指標均顯著低于H對應組（均P < 0.01），H-1h組顯著高于H-0、6 h組（均P < 0.01），M-1 h組顯著高于M-0、6 h組（均P < 0.01）。各組p38與C組均無顯著性差異（P > 0.05）。

2.2 Phospho-p65和p65

圖2顯示，H-0、1、6 h組Phospho-p65均顯著高于C組（均P < 0.01），M-0、1 h組指標均顯著高于C組（均P < 0.01），但均顯著低于H對應組（均P < 0.01）。H-1 h組指標顯著高于H-0、6 h組（均P < 0.01），M-1 h組指標顯著高于M-0、6 h組（均P < 0.01）。各組p65與C組均無顯著性差異（P > 0.05）。

2.3 IL-6 mRNA

圖3顯示，H-0、1、6 h組指標均顯著高于C組（均P < 0.01），M-0、1 h組指標均顯著高于C組（均P < 0.01），但顯著低于H對應組（均P < 0.05）。H-1h組指標與H-0 h組無顯著差異（P > 0.05），但顯著高于H-6 h組（P < 0.01）。M-1 h組指標顯著低于M-0 h 組（P < 0.01）。

2.4 MRFs mRNA及MyoD mRNA/MyoG mRNA比值

圖4顯示，H-6 h、M-6 h 組MyoD mRNA均顯著高于C組（均P < 0.01），H-6 h 組指標顯著高于M對應組（P < 0.05）。

圖5顯示，H-6 h、16 h組MyoG mRNA均顯著高于C組（均P < 0.01），M各組與C組均無顯著性差異（P > 0.05）。

圖6顯示，H-6h、M-6h組MyoD mRNA/MyoG mRNA比值顯著高于C組（均P < 0.01）。H-16組顯著低于C組（均P < 0.01）。

圖7顯示，各組Myf-5 mRNA均與C組無顯著性差異（P > 0.05）。

圖8顯示，H-1、6 h組MRF4 mRNA均顯著高于C組（均P < 0.01），H-6 h組指標顯著高于H-1組（P < 0.05）。M各組指標均與C組無顯著性差異（P > 0.05）。

2.5 MEF2c mRNA

圖9顯示，H-0、1、6 h組和M-0、1h組MEF2c mRNA顯著高于C組（均P < 0.01），且M-0、1 h組指標顯著低于H對應組（均P < 0.05）。H-1h組指標顯著高于H-0h組（P < 0.05）和H-6h組（P< 0.01），M-0、1 h組之間無顯著性差異（P > 0.05）。

3 討論

3.1 運動對p38、NF-B活性、IL-6 mRNA的影響

多數研究認為p38有助肌肉發生，但也有研究提出，p38對肌肉的發生作用取決于其所處的肌肉發生階段。Weston報道，肢芽培養過程抑制p38卻促進了肌管的形成，該研究認為，p38在肌肉發生的分化和分化后階段起到相反作用，p38會促進肌肉干細胞的分化，但隨后為了避免形成早熟的肌管，又抑制了已分化細胞的延長、極化、聚集和融合［5］。目前，對肌肉發生分化后階段的分子事件了解還很匱乏，Weston的結果也有待更多證據來支持。本研究發現，M-0、1、6 h組及H-0、1、6h組P-p38上調（與C組相比），且H-0、1、6h組上調幅度較大（與M對應組相比），而p38始終未變。結果提示，p38在急性運動后早期即可激活，激活幅度有強度依賴性，急性運動不影響p38總水平?？紤]到運動對于肌肉發生和存活是有益的，因此激活的p38作用應與此一致而非相悖，p38激活的運動強度依賴性也與已知的“運動強度越大，肌肉發生效果越好”相符。已知p38調節肌肉發生有多個途徑［6-8］，調節MRFs及MEF2活性或含量是其中之一，有報道，p38可以直接磷酸化并增強MEF2a、2c的轉錄活性，也能誘導Myf-5、MyoG等成肌因子及MEF2表達，具體機制未知［8-11］，但可能該調節存在 NF-κB 依賴性［4］。

體外研究顯示，p38調控NF-κB的途徑主要有兩條：誘導IκBa從NF-κB分離，允許NF-κB進入細胞核與DNA結合；通過CBP/P300間接誘導p65的轉激活［4］。本研究檢測P-p65發現，H-0、1、6 h及M-0、1組指標上調（與C組相比），且H-0、1h組指標較高（與M對應組相比）。這提示，NF-B激活的幅度及持續時間都具有運動強度依賴性。除運動強度依賴性外，P-p65與P-p38動力學特征還有諸多相似點——大強度運動后，二者上調時段完全一致（0、1、6 h）；中等強度運動后，二者均在0、1h上調，但是P-p65恢復正常水平時間（6 h）早于P-p38（16 h）；大、中強度條件，二者峰值出現時刻相同（1h）。上述表明，運動誘導下，二者動力學特征相似，特別是在大強度條件下。筆者推測，運動條件下，p38是NF-κB的調節劑，而NF-κB則承繼了p38的生物信號。當然，生物信號干擾因素眾多，運動條件下NF-κB 的變化是否為p38依賴性仍需p38激動劑或阻斷劑來確認。本研究發現，運動不影響p65水平，這與以往研究報道一致。近年來，研究已確認，NF-κB作用絕不是單純的擴大炎癥級聯反應、引起肌肉質量流失或肌肉萎縮［13-15］，某些條件下，NF-κB對于肌肉的發生或生存有促進作用——IGF-II誘導的L6E9大鼠成肌細胞發生過程中NF-κB被激活［16］，阻斷NF-κB下調C2C12細胞某些結構蛋白和功能蛋白的表達［4］，經過運動訓練，老年大鼠肌肉NF-B活性提高、衰老引起的肌肉流失減緩、肌肉功能得到改善［2］。本研究采用的是對肌肉發育和存活有益的向心收縮運動，因此NF-B激活作用也應該與此一致而不太可能是促進炎癥或肌肉流失。對于NF-B矛盾的功能，Ho提出，持續的NF-B激活可能導致肌肉損傷和流失（如傷病），間歇式的NF-B激活可能促進正常肌肉發育（如運動）［16］，但Ho只明確了現象而未解釋其機理。轉錄因子最終效用依賴于激活的基因，因此筆者認為，病理性反應中NF-B激活與運動性NF-B激活作用差異實際提示了不同條件下，轉錄因子NF-B將選擇性激活編碼不同功能蛋白的基因?；蜻x擇性激活的機制將是未來研究的具體方向。NF-B靶基因中不包括肌肉特異性基因，也不包括肌肉發生核心調控因子MRFs或肌肉發生增強因子MEF2的基因，它對肌肉發生調節可能部分與其靶基因IL-6有關［3］。

IL-6與IL-1等炎癥因子不同，與損傷及炎癥關聯并不大，并且有助于多種細胞的發生，如造血干細胞的增殖、B細胞的分化與成熟、T細胞的增殖與分化、肝細胞分化、神經細胞的分化、神經膠質細胞的增生等［9］。IL-6也是肌肉發生所必需的，IL-6-/-小鼠的肌肉發育明顯遲緩［3］。本研究發現，M-0、1 h組及H-0、1、6 h組IL-6 mRNA上調（與C組相比），且H-0、1 h組IL-6 mRNA較高（與M對應組相比）。對比P-p65與IL-6的動力學特征，發現二者很相似——在大強度和中等運動強度下，P-p65上調時段均與IL-6 mRNA上調時段完全一致；二者上調幅度和時間均具有運動強度依賴性。研究提示，運動條件下，NF-B激活是IL-6基因表達重要誘因。

3.2 運動對MRFs、MEF2c mRNA的影響

MRFs是肌肉發生通路主要效應因子，能夠促進肌肉特異性基因（如-actin、煙堿乙酰膽堿受體、-原肌球蛋白、MHC、結蛋白、肌鈣蛋白C、CK、MCK等）表達、激活，引導肌肉成體干細胞增殖或分化。MEF2則是MRFs的增強子。本研究發現：H-6 h、M-6 h組MyoD mRNA上調（與C組相比），H-6 h組上調較大（與M對應組比）；H-6、16 h組MyoG mRNA上調、M組未變；H、M組Myf-5 mRNA均未變；H-1、6 h組MRF4 mRNA上調、M組未變；H-0、1、6 h組MEF2c mRNA上調、M-0、1 h組上調，且H-0、1h組較高（與M對應組比較）。結果提示，MyoD、MEF2c mRNA對大、中強度運動刺激均敏感，MyoG、MRF4基因表達只對較高強度運動刺激有反應，Myf-5對運動刺激不敏感，推測它對運動誘導肌肉重塑的意義不大。與MRFs mRNA相比，H、M組MEF2c mRNA上調均較早（0 h），作為MRFs的輔助因子，它在運動早期的上調目的可能在于為MRFs激活肌肉特異基因的表達做好準備。已知MRFs表達具有一定時空特征，時間上，Myf-5、MyoD在衛星細胞激活、增殖生成成肌細胞過程中開始上調，而MRF4與MyoG在成肌細胞分化為肌管期開始上調；空間分布上，MyoD高表達于快肌，MyoG高表達于慢?。?7］；功能上，MRFs成員有重疊，也有差異，目前尚未完全研究清楚。一些研究認為，MyoD、Myf-5引導衛星細胞的激活（增殖形成成肌細胞），而MRF4、MyoG則引導分化（成肌細胞分化為肌管）［18］，也有研究認為MyoD與MRF4均參與了肌肉干細胞增殖與分化的調控［19，20］。本研究中，MRFs mRNA 結果表明，急性運動釋放了促肌肉增殖或分化的信號。MyoD與MyoG也是決定肌肉表型的關鍵因子，MyoD可激活MHC IIb、X及某些酵解酶基因轉錄，促進快肌生成和發育，相反，MyoG有助MHC I、IIa和某些氧化酶基因轉錄，促進慢肌的生成發育［16］，因而，二者比值變化反映了肌肉表型轉化的波動。本研究發現，H-6 h組MyoD mRNA/ MyoG mRNA比值上升、H-16 h組比值下降、H-24 h恢復正常（與C組相比），提示，大強度運動后早期，肌肉類型變化為慢—快，后期則相反，為快—慢型轉化，不難看出，這個波動特征與超量恢復類似，在恢復過程中會有個變化的“反轉”，然后再回到正常水平。M-6 h組該比值上升、M-16h組恢復正常（與C組相比），顯然，中等強度后，該比值恢復正常（16 h）比大強度（24 h）要早，提示，急性中等運動后早期，肌肉類型轉換也為慢—快，類型轉化過程在較短時間即恢復運動前水平。研究中，我們沒有觀察到中等強度后，類似大強度運動后出現的比值變化的“反轉”，考慮到中等強度對肌肉的快—慢轉化效果更強于大強度運動，“反轉”應該存在，推測“反轉”應該發生在6-16 h之間。大強度運動后，MRFs mRNA上調順序是MRF4、MyoD及MyoG，中等強度后，只有MyoD上調，MRFs基因表達次序與不同特征的肌肉的塑造有何聯系值得進一步調查。需要指出，MRFs、MEF2c均為轉錄因子，判斷其功能最佳指標是DNA結合活性而非mRNA或蛋白水平，未來研究還需要補充這方面的數據。

3.3 IL-6與MEF2c及MRFs的聯系

本研究中，MRFs及MEF2 mRNA的變化體現了急性運動對肌肉發生進程的干預，它的上游機制為何？細胞生物學研究發現，IL-6-/-能夠抑制肌肉發生［3］，以往研究也有報道提出，IL-6可能是介導p38、NF-B肌肉發生信號的重要環節［4］，是否急性運動誘導下， IL-6通過上調肌肉發生主要效應因子MRFs或MEF2c的基因表達來加強肌肉生物發生進程？它們之間關系是否密切？本研究對IL-6 mRNA及MRFs、MEF2 mRNA的動力學特征進行了比較。

本研究發現，大、中強度運動后，IL-6與MEF2c mRNA 上調期完全相同（分別是 0、1、6 h；0、1 h），并如前文所述，二者上調幅度和時間均為運動強度依賴性的；中等強度后，IL-6 mRNA上調（0、1 h）早于 MyoD mRNA上調（6 h），并且二者上調時段無交集，其余MRFs mRNA未改變，因此無需比較；大強度運動后，IL-6 mRNA上調（0、1、6 h）早于 MyoD mRNA（6 h）、MyoG mRNA（6、16 h）、MRF4 mRNA（1、6 h），即上調時段有部分一致。將指標變化時段的相似程度視為衡量因子之間關聯程度密切與否的標尺，本研究推斷，運動條件下，IL-6可能對MEF2c基因表達有比較直接的作用，中等強度運動下，它與MyoD、MyoG、MRF4的基因表達可能無直接關聯，然而，這個關聯在運動強度增大時可能變得緊密。IL-6與MRFs及MEF2c的關系仍需通過IL-6基因敲除等手段來驗證，特別需要指出，MRFs成員之間、MRFs與MEF2c會相互影響，如MyoD與Myf-5能夠上調MyoG［21］，MRF4 可 以 上 調 MyoG 和 MEF2［22］，但又會引起MyoD的降解［21］，未來研究方案設計如何排除指標相互干擾，確認IL-6等因子與MRFs各成員具體關系還是個難點。

4 總結

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