補(bǔ)充蒺藜提取物對過度訓(xùn)練大鼠T淋巴細(xì)胞亞群和NK、NKT細(xì)胞的影響

孫婧瑜 楊文吉 王茹 曲靜 游盛中 王曉慧

上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院（上海 200438）

過度或激烈運(yùn)動(dòng)會(huì)降低機(jī)體免疫力，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制（exercise-related immunosuppression），所以訓(xùn)練或比賽后常有運(yùn)動(dòng)員抵抗力下降，出現(xiàn)感染性疾病，如上呼吸道感染、病毒性肝炎等，影響其運(yùn)動(dòng)能力，甚至停訓(xùn)停賽。因此尋找合適的解決方法避免或改善運(yùn)動(dòng)性免疫功能抑制，對提高運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)能力具有重要意義。

蒺藜有草中名藥之稱，它含有皂苷類、黃酮類和甾醇類等化合物，皂苷是蒺藜的主要有效成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蒺藜皂苷有性強(qiáng)壯、降血壓、降血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用［1］。關(guān)于蒺藜調(diào)控免疫功能及其機(jī)制的相關(guān)研究剛開展，有限的研究認(rèn)為，蒺藜水提取物能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能［2］；蒺藜皂苷能增強(qiáng)機(jī)體自然殺傷細(xì)胞活性，預(yù)防老年人免疫功能降低［3］。蒺藜是否能改善過度運(yùn)動(dòng)所致的運(yùn)動(dòng)性免疫抑制尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選擇T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+/CD8+比值、輔助性T細(xì)胞（Th）1/Th2細(xì)胞平衡以及NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞數(shù)量等免疫學(xué)指標(biāo)，研究了蒺藜提取物對過度訓(xùn)練所致的運(yùn)動(dòng)性免疫抑制大鼠免疫功能的影響，以探討蒺藜提取物對過度訓(xùn)練導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，為開發(fā)蒺藜作為過度訓(xùn)練的免疫改善制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

30只健康雄性SD大鼠購自上海第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SYXK（滬）2007－0003］，8周齡，隨機(jī)分為安靜對照組、過度訓(xùn)練組和蒺藜+過度訓(xùn)練組3組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 訓(xùn)練方案

對照組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。過度訓(xùn)練組和蒺藜＋過度訓(xùn)練組正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行3天跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練。正式訓(xùn)練方案參照Bedford方法［4］改良，采用6周遞增強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，其強(qiáng)度、坡度和持續(xù)時(shí)間分別為15 m/min、5%、30 min（第1周）；20 m/min、5%、60 min（第2周）；25 m/min、10%、90 min（第3周）；30 m/min、15%、90 min（第4周）；30 m/min、15%、120 min（第5周）；35 m/min、15%、120 min（第6周）。每周訓(xùn)練6天，休息1天。

1.2.2 蒺藜提取物的補(bǔ)充方式

蒺藜提取物（含總皂苷60%以上）購自西安三維生物技術(shù)有限公司，將其配制成濃度為24 mg/ml的溶液。每次訓(xùn)練前30 min，過度運(yùn)動(dòng)+蒺藜組以120 mg/kg體重的劑量灌胃服用蒺藜提取物，對照組和過度訓(xùn)練組灌服等體積的生理鹽水。

1.2.3 取材及指標(biāo)檢測

體重檢測：每周一上午用天平稱量各組大鼠體重。

內(nèi)分泌激素檢測：第7周周一上午大鼠眼眶靜脈叢采血0.5 ml后用ELISA試劑盒（上海申能博采生物科技有限公司）檢測外周血皮質(zhì)酮（C）、睪酮（T）水平。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

免疫細(xì)胞檢測：第7周周一上午，使用肝素真空采血針抽取大鼠腹主靜脈血，并向100 μl抗凝血中加入20 μl抗體，混勻后25℃恒溫器中孵育1 h，溶紅細(xì)胞后放入恒溫器10～20 min，1500 r/ min離心5 min，取上清液用生理鹽水洗1～2次，1500 r/ min離心5 min后上流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司）檢測CD3+、CD4+、CD8+、NK、NKT細(xì)胞數(shù)及IFN-、IL-4分泌量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，過度訓(xùn)練組分別與安靜對照組和蒺藜+過度訓(xùn)練組比較，采用單因素方差分析，顯著性水平為P < 0.05，非常顯著性水平為P < 0.01。

2 結(jié)果

2.1 大鼠外觀狀態(tài)、體重及內(nèi)分泌指標(biāo)

過度訓(xùn)練組第4、5、6周各有1只大鼠死亡，原因不清；蒺藜+過度訓(xùn)練組第5周有2只死亡。實(shí)驗(yàn)后期，過度訓(xùn)練組大鼠反應(yīng)遲鈍，精神萎靡不振，眼神暗淡無光，毛發(fā)脫落等，而蒺藜+過度訓(xùn)練組大鼠也出現(xiàn)相似表現(xiàn)，但程度比過度訓(xùn)練組輕。

表1顯示，實(shí)驗(yàn)前（0周）各組大鼠體重?zé)o顯著性差異，從第3周開始過度訓(xùn)練組大鼠體重顯著低于安靜對照組（約是對照組的82%，P < 0.01），至第6周時(shí)約是對照組的76%（P < 0.01）。第4周和第6周蒺藜＋過度訓(xùn)練組大鼠體重與過度訓(xùn)練組比較顯著增加（P < 0.05），但仍顯著低于安靜對照組（P < 0.01）。

表1 3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間體重的變化

表2顯示，與過度訓(xùn)練組相比，蒺藜+過度訓(xùn)練組睪酮水平顯著增加（P < 0.05），皮質(zhì)酮水平顯著降低，約是過度訓(xùn)練組的一半，且低于安靜對照組（P < 0.05），T/C比值大幅增加，是安靜對照組的1.95倍（P < 0.01）。

表2 3組大鼠血漿睪酮、皮質(zhì)酮及T/C比值比較

2.2 免疫指標(biāo)

2.2.1 CD3+細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+比值

表3顯示，蒺藜＋過度訓(xùn)練組大鼠CD+/CD+48比值顯著增加，遠(yuǎn)超過安靜對照組，是其水平的2.04倍。蒺藜＋過度訓(xùn)練組大鼠CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量與過度訓(xùn)練組比較雖有增加趨勢，但無顯著差異，且仍顯著低于安靜對照組（P < 0.05）。

表3 3組大鼠CD3+細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+比值比較

2.2.2 IFN-γ和IL-4

如表4所示，與安靜對照組相比，過度訓(xùn)練組大鼠Th1型特征性細(xì)胞因子IFN-和Th2型特征性細(xì)胞因子IL-4均顯著增加（P < 0.01），IFN-/IL-4比值顯著降低（P < 0.05），表明過度訓(xùn)練大鼠Th1/Th2失衡，向Th2方向漂移；而補(bǔ)充蒺藜提取物后過度訓(xùn)練大鼠IFN-水平顯著增加（P < 0.01），IL-4水平顯著降低（P < 0.01），IFN-/IL-4比值明顯升高，接近安靜對照組水平。

表4 3組大鼠IFN-和IL-4比較

表4 3組大鼠IFN-和IL-4比較

*P < 0.05，**P < 0.01：與安靜對照組比較；#P < 0.05，# #P <0.01：與過度訓(xùn)練組比較。

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2.2.3 NK、NKT細(xì)胞數(shù)

表5顯示，與過度訓(xùn)練組相比，蒺藜+過度訓(xùn)練組大鼠NK、NKT細(xì)胞均顯著增加（P < 0.05），NKT細(xì)胞數(shù)量顯著高于安靜對照組（P < 0.05）。

表5 3組大鼠NK、NKT細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

3.1 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性免疫抑制模型的建立

大鼠運(yùn)動(dòng)性免疫抑制模型的成功建立是本研究的基礎(chǔ)。因此，我們首先檢驗(yàn)6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后大鼠是否出現(xiàn)過度訓(xùn)練。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過度訓(xùn)練大鼠體重顯著降低，運(yùn)動(dòng)后期反應(yīng)遲鈍，精神萎靡不振，眼神暗淡無光，毛發(fā)脫落等，血漿T/C比值明顯下降，表明大鼠出現(xiàn)了過度訓(xùn)練；結(jié)合CD3+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量明顯減少、Th1/Th2失衡說明本實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)方案成功建立了過度運(yùn)動(dòng)所致的運(yùn)動(dòng)性免疫抑制動(dòng)物模型。

3.2 蒺藜提取物對過度訓(xùn)練大鼠免疫功能的影響

T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞免疫反應(yīng)中有重要作用，T細(xì)胞數(shù)量增加和CD4+/CD8+比值升高反映免疫功能改善。本研究發(fā)現(xiàn)，與過度訓(xùn)練組比較，蒺藜+過度訓(xùn)練組大鼠CD4+/CD8+比值明顯增加，是安靜對照組的2倍左右，但CD3+T細(xì)胞數(shù)量僅有增加趨勢，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明蒺藜提取物通過增加CD4+/CD8+比值增強(qiáng)過度訓(xùn)練大鼠的免疫功能。

Th1細(xì)胞主要負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫，Th2細(xì)胞與體液免疫有關(guān)。IFN-、IL-4被認(rèn)為是Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的特征性因子，因此用IFN-/IL-4比值反映Th1/Th2平衡情況［5，6］。Mueller等發(fā)現(xiàn)重復(fù)性力竭運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致競技運(yùn)動(dòng)員IFN-下降，使Th1/Th2平衡向Th2漂移，導(dǎo)致免疫功能下降［7］。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室也得到了類似的結(jié)果［5，8，9］。目前認(rèn)為過度運(yùn)動(dòng)所致的運(yùn)動(dòng)性免疫抑制是因?yàn)檫^度運(yùn)動(dòng)抑制Th細(xì)胞向Th1分化，促進(jìn)其向Th2分化，使Th1/Th2平衡向Th2漂移，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能降低而體液免疫增強(qiáng)所致［5，8，9］。本研究顯示過度訓(xùn)練組大鼠IFN-/IL-4比值顯著降低，Th1/Th2平衡向Th2方向漂移，此與前人研究結(jié)果一致。而補(bǔ)充蒺藜提取物后過度訓(xùn)練大鼠IFN-/IL-4比值顯著上升，表明蒺藜可改善由于過度訓(xùn)練導(dǎo)致的Th1/Th2失衡，使其不向Th2方向漂移，促進(jìn)Th1/Th2恢復(fù)平衡。

NK細(xì)胞是具有自然殺傷能力的淋巴細(xì)胞，在機(jī)體免疫防御反應(yīng)中起重要作用。NKT細(xì)胞是特殊類型的T細(xì)胞亞群，其細(xì)胞表面既有T細(xì)胞受體，又有NK細(xì)胞受體。運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致免疫細(xì)胞發(fā)生數(shù)量及功能變化，而免疫細(xì)胞中以NK細(xì)胞變化最敏感，可以作為早期診斷運(yùn)動(dòng)性疲勞的監(jiān)測指標(biāo)［10，11］。NKT也是反映運(yùn)動(dòng)后免疫功能改變的較敏感指標(biāo)，受運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)量影響［12，13］。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充蒺藜提取物可使大鼠NK、NKT細(xì)胞數(shù)量顯著增加，甚至超過安靜對照組水平，表明蒺藜提取物通過增加NK、NKT細(xì)胞數(shù)量改善過度運(yùn)動(dòng)大鼠免疫功能。增加的NKT細(xì)胞不僅有助于CD8+殺傷性T細(xì)胞的分化［14］，而且大大增強(qiáng)了NK細(xì)胞的殺傷活性［15］，提高機(jī)體免疫功能。

3.3 蒺藜提取物增強(qiáng)過度訓(xùn)練大鼠免疫功能的可能機(jī)制

作為免疫抑制劑的糖皮質(zhì)激素能促進(jìn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的凋亡，抑制炎癥因子的分泌，從而抑制免疫功能，而糖皮質(zhì)激素對運(yùn)動(dòng)中免疫功能的抑制作用也得到多篇文獻(xiàn)的證實(shí)。長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)的免疫抑制與糖皮質(zhì)激素的濃度升高有關(guān)［16］；糖皮質(zhì)激素的濃度與馬拉松運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)后1.5 h和3 h的循環(huán)淋巴細(xì)胞的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［17］；運(yùn)動(dòng)后增加的糖皮質(zhì)激素降低NK細(xì)胞的數(shù)量［18］以及降低踏車小鼠頜下淋巴結(jié)CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量［19］；次最大強(qiáng)度踏車運(yùn)動(dòng)所致的糖皮質(zhì)激素的增加與其促進(jìn)胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞的凋亡有關(guān)［20］；糖皮質(zhì)激素通過影響運(yùn)動(dòng)過程中的Th1/Th2不同細(xì)胞因子的分泌，使Th1/Th2失衡，向Th2漂移［21，22］等。以上結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素的升高至少是運(yùn)動(dòng)性免疫抑制發(fā)生的原因之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與過度訓(xùn)練組大鼠相比，蒺藜＋過度訓(xùn)練組大鼠血漿皮質(zhì)酮水平明顯降低（約為過度訓(xùn)練組的50%），伴有免疫功能顯著增強(qiáng)；而過度訓(xùn)練大鼠血漿皮質(zhì)酮水平有升高的趨勢并伴有免疫功能降低，因此，推測蒺藜提取物對免疫功能的增強(qiáng)作用很可能與其降低皮質(zhì)酮水平有關(guān)。至于過度訓(xùn)練組大鼠的血漿皮質(zhì)酮水平?jīng)]有顯著增加的原因，可能與采血時(shí)間較晚（在運(yùn)動(dòng)后的第3天上午采血，約是運(yùn)動(dòng)后38小時(shí)），升高的血漿皮質(zhì)酮水平已有所恢復(fù)有關(guān)。

4 總結(jié)

蒺藜提取物增強(qiáng)過度訓(xùn)練大鼠受抑制的免疫功能，包括增加過度訓(xùn)練大鼠血漿CD4+/CD8+比值和NK、NKT細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)Th1/Th2失衡的改善，使其恢復(fù)平衡。蒺藜提取物對過度訓(xùn)練大鼠免疫功能的增強(qiáng)作用很可能與其降低血漿皮質(zhì)酮水平有關(guān)。

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