注射氫水對一次性力竭運動大鼠骨骼肌氧化應激損傷的影響

李愛春 張林 周君來 孫學軍

1 浙江體育職業技術學院（杭州 310012） 2 蘇州大學體育學院 3 浙江工業大學 4 第二軍醫大學

國內外研究表明，氫氣是一種優質抗氧化物質，通過呼吸氫氣或飲用、注射含氫液體——氫水，可治療缺血再灌注損傷［1-3］、神經損傷［4］、器官炎癥［5，6］、藥物毒性［7］、小鼠基因缺陷［8］、帕金森病［9］和人類II型糖尿病［10］等慢性氧化應激損傷，其基礎是氫氣的選擇性抗氧化作用［1］，即選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子等導致氧化損傷重要介質的能力。而有關氫水抗氧化作用的研究剛起步，已有的研究多集中于醫學實驗，在體育科研領域迄今尚無涉足，有關氫水對運動性氧化應激損傷的防治研究仍屬空白。本實驗以骨骼肌為研究對象，探討氫水對力竭運動大鼠氧化應激損傷的影響，為評價氫水生物學作用和運動氧化損傷防治提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 動物分組

浙江省醫學科學院實驗動物中心提供的30只清潔級健康雄性SD大鼠，3月齡，體重300～350g，按體重配對后隨機分成安靜對照組（C組）、運動對照組（E組）與運動給氫組（H組）3組，每組10只。分籠飼養，每籠2只，自由飲食飲水。飼料、智能屏障動物實驗室及動物飼育管理均由浙江省醫學科學院統一提供，光照時間為8:00～18:00，動物室內溫度22±3℃，相對濕度為50±5%。所有動物實驗前均未進行過跑臺運動。

1.2 實驗方案

氫水購自上海基量標準氣體有限公司。氫氣飽和生理鹽水的制備: 在0.5 MPa壓力下加壓暴露4 h，將純氫氣溶解于正常生理鹽水中達到飽和，4℃貯存。

C組不運動。正式實驗前2天，E組和H組每天進行1次適應性低強度跑臺運動（BCPT-98型電動動物跑臺由杭州段式提供），坡度0，速度10 m·min-1，持續10 min。正式實驗時，H組于運動前腹腔注射10 ml·kg-1體重氫水，E組腹腔注射同體積生理鹽水，后采用Marra方案［11］進行一次性大強度力竭跑臺運動。坡度0，初始速度10 m·min-1，10 min內增加至28 m·min-1（超過90%VO2max），持續運動至力竭。運動時使用聲、光或毛刷刺激大鼠尾部以保證運動強度。力竭判定標準：運動末期動物不能堅持原跑速，先后滯留跑道后1/3處達3次以上，刺激驅趕無效，停跑后體征表現為呼吸急促，神情倦怠，腹臥位，對刺激反應遲鈍。

1.3 取材與指標測試

E組和H組均于力竭運動后3 h采用股動脈放血法處死，取兩側后肢腓腸肌中段，剔除筋膜，迅速置于干冰中冷凍待測。整個取樣時間約1 min。同樣方法處死C組，取腓腸肌，待測。

試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，嚴格按試劑盒說明書進行操作。采用化學比色法測定SOD、MDA、GSH、TAOC活性，采用Elisa法測試3-硝基酪氨酸（3-NT）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）濃度。

1.4 統計學分析

用EXCEL和SPSS軟件對所獲得數據進行正態檢驗和雙因素方差分析，結果以± s表示。P < 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨骼肌氧化應激指標

表1顯示，與C組比較，E組3-NT、MDA與8-OHdG 均顯著升高（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01），H組3-NT無明顯變化，MDA顯著低于C組（P <0.01），8-OHdG濃度顯著高于C組（P < 0.05）；與E組比較，H組3-NT無顯著變化，MDA、8-OHdG均顯著降低（P < 0.01，P < 0.05）。

2.2 骨骼肌抗氧化酶活性

表2顯示，與C組比較，E組SOD、GSH活性顯著降低（P < 0.05），TAOC有所降低，但無統計學意義；H組SOD、GSH、TAOC活性與C組比較無明顯差異；但顯著高于E組（P < 0.01，P <0.01，P < 0.05）。

表2 各組大鼠骨骼肌抗氧化酶活性比較

3 討論

氧化應激是指機體組織或細胞內氧自由基生成增加和／或清除能力降低，導致活性氧在體內或細胞內蓄積而引起的氧化損傷過程。氧自由基在體內具有不穩定性和較高的化學反應性，可以攻擊蛋白質、脂質以及DNA等生物分子，形成一系列氧化損傷產物［12］。3-NT是活性氧存在的條件下，高毒性的過氧亞硝酸（ONOO-）使游離酪氨酸或蛋白質酪氨酸硝基化形成的穩定的終末代謝物，是蛋白質硝基化的特異性標志物，是介導氧化應激損傷作用的重要環節，是近年來細胞損傷機制研究的熱點之一。研究顯示，在氧化應激過程中，3-NT的產生可引起細胞內蛋白質和酶變性失活、DNA損傷、細胞死亡和凋亡［13］。MDA是脂質過氧化的最終產物，是反映體內脂質過氧化水平的敏感指標，檢測MDA水平可間接反應氧化膜氧化損傷反應的程度。8-OHdG是DNA組分之一的脫氧鳥苷在活性氧作用下的特異產物，是內源性及外源性因素導致DNA氧化損傷的生物標志物［14］。在體育科研領域，MDA是運動氧化損傷防治的常用指標，而有關3-NT、8-OHdG的研究甚少。

本研究結果表明，力竭運動使骨骼肌氧自由基增加，抗氧化酶活性降低，氧化應激加強，引起骨骼肌細胞酪氨酸殘基硝化、脂質過氧化與DNA羥化，導致大鼠骨骼肌蛋白質氧化、脂質過氧化與DNA損傷。氫水降低了上述損傷，對力竭運動大鼠骨骼肌氧化應激損傷具有保護作用。其保護作用的基礎可能是氫水的選擇性抗氧化。由于氫還原性較弱，不與信號作用、氧化作用弱的活性氧直接反應，但與活性強、毒性強的活性氧，如ONOO-與OH-直接發生反應。Gharib［5］等研究認為氫氣與OH-直接反應是治療炎癥等損傷的基礎。Ohsawa［1］等采用化學反應、細胞學等實驗證明，氫氣溶解在液體中可選擇性中和氧化損傷的重要介質 — ONOO-與OH-，直接清除毒性強的氧自由基，起到自由基清除劑的作用。

本研究中，一次性力竭運動后大鼠骨骼肌SOD、GSH含量下降，可能與運動中胰高糖素、兒茶酚胺和血管加壓素釋放增加有關。TAOC下降可能與運動中活性氧高水平產生，血流改變、能量供應與還原態能量利用能力降低有關［15］。補充氫水組SOD、GSH與TAOC活性升高可能與氫氣的特性有關。氫氣具有低密度、小分子、易擴散的特性，可有效改善微循環，降低微循環阻抗，因而增加組織供氧，降低氧化應激。另一方面，由于抗氧化的源頭是能源物質代謝，氫水可能參與了能量代謝，影響NAPH氧化酶的產生，發揮了信號作用［10，16］。這提示氫氣可能是一種新的生物活性物質，具有廣泛的應用前景。

4 總結

氫水能降低骨骼肌ONOO-、過氧化脂質類與OH-等的代謝水平，提高骨骼肌抗氧化酶活性，增強骨骼肌的總抗氧化能力，改善力竭運動大鼠骨骼肌蛋白質氧化損傷、脂質過氧化損傷及DNA損傷，對骨骼肌運動性氧化應激損傷具有保護作用。

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