經(jīng)皮穴位電刺激對大運(yùn)動量耐力訓(xùn)練大鼠骨骼肌NO、TNOS及iNOS含量的影響

游世晶 具紫勇 夏勇 李藝 何金森

上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院（上海 201203）

近年來，應(yīng)用中醫(yī)藥方法特別是針灸防治運(yùn)動性疲勞已受到廣泛關(guān)注。但針刺有一定的創(chuàng)傷性，運(yùn)動員對其有一定的懼怕心理，因此其在比賽和訓(xùn)練中的應(yīng)用受限。而經(jīng)皮穴位電刺激（transcutanclus electrical acupoint stimulation，TEAS）克服了這個缺點(diǎn)，具有無創(chuàng)傷、易操作、便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)，利于廣泛應(yīng)用。TEAS用于治療運(yùn)動性疲勞的研究還處于起步階段，研究表明TEAS可以減少血乳酸堆積、減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力，從而提高機(jī)能水平，延緩運(yùn)動性疲勞發(fā)生［1-4］。但TEAS對過量運(yùn)動引起骨骼肌疲勞方面作用的研究報道較少，此外，目前的研究普遍認(rèn)為運(yùn)動對一氧化氮（NO）及其合酶（NOS）的影響與運(yùn)動強(qiáng)度有關(guān)，適當(dāng)強(qiáng)度的運(yùn)動可適當(dāng)提高機(jī)體NO及NOS活性，而過度訓(xùn)練會導(dǎo)致機(jī)體NO過度升高，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠跑臺運(yùn)動疲勞模型，觀察TEAS對大鼠骨骼肌NO、總一氧化氮合酶（TNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）含量的影響，探討TEAS在防治運(yùn)動性骨骼肌疲勞方面的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

40只純種清潔級SD雄性大鼠，體重200～220 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。飼養(yǎng)溫度18～21℃，相對濕度40%～60%，每天光照12 h，大鼠自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每天以10 m/min的速度進(jìn)行適應(yīng)性跑臺練習(xí)，連續(xù)3天，每天15 min。練習(xí)后，將大鼠按體重隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、正常刺激組、治療1組和治療2組，每組8只。

1.2 運(yùn)動方案

訓(xùn)練強(qiáng)度參照Bedford運(yùn)動負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)［5］，大鼠以15 m·min-1×15 min的負(fù)荷開始訓(xùn)練，隔日速度增加2 m·min-1，時間增加5 min，當(dāng)負(fù)荷遞增至38 m·min-1×60 min時，維持此負(fù)荷訓(xùn)練至8周結(jié)束，每周訓(xùn)練6天。訓(xùn)練中使用小木棍或毛刷刺激動物尾部，使動物保持在跑道前1/3處，以保證運(yùn)動強(qiáng)度。運(yùn)動過程中未使用聲、光、電刺激，以避免大鼠的應(yīng)激反應(yīng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.3 干預(yù)方法

用電動剃毛器分別于大鼠后足三里、環(huán)跳穴位備皮，75%酒精局部消毒，注意避免皮膚損傷。環(huán)跳穴在后肢髖關(guān)節(jié)后上緣；（后）足三里穴在后肢后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處［6］。

正常組：常規(guī)飼養(yǎng)，每天使大鼠俯臥于自制大鼠固定器上15 min，無任何干預(yù)。

模型組：進(jìn)行8周跑臺運(yùn)動，每天使大鼠俯臥于自制大鼠固定器上15 min，無其它干預(yù)。

正常刺激組：不運(yùn)動。每天使大鼠俯臥于自制大鼠固定器上，分別于足三里、環(huán)跳穴處放一直徑約0.5 cm的電極片，與韓氏HANS-200E穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）連接，選用疏密波模式刺激15 min，頻率2～15 Hz，強(qiáng)度2.5 mA。

治療1組：于跑臺訓(xùn)練前對大鼠進(jìn)行經(jīng)皮穴位電刺激，方法同正常刺激組，結(jié)束后1h再進(jìn)行跑臺運(yùn)動，共8周。

治療2組：從跑臺訓(xùn)練第2周起，每次運(yùn)動訓(xùn)練后1 h對大鼠進(jìn)行經(jīng)皮穴位電刺激，方法同正常刺激組，共7周。

1.4 取材及處理

末次訓(xùn)練治療后，各組大鼠禁食不禁水，24 h后分別用電子秤稱量各組大鼠體重，后用2%戊比巴妥鈉30 ml/kg腹腔注射麻醉后，迅速取右后肢腓腸?。ūM可能去除脂肪組織和結(jié)締組織），稱取適量腓腸肌加0.9%生理鹽水，按W（g）:v（m）=1:10制成勻漿，分離上清液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)檢測

在實(shí)驗(yàn)中觀察大鼠的一般情況，包括神態(tài)、活動、反應(yīng)、食欲、二便等。采用硝酸還原酶法測試NO；采用比色法測定NOS活性；采用考馬斯亮蘭法進(jìn)行組織蛋白定量。試劑由南京建成生物工程研究所提供（批號20091121），具體檢測過程嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

大鼠一般情況：實(shí)驗(yàn)前各組大鼠神態(tài)安靜，活動正常，對外界刺激及周圍環(huán)境的變化反應(yīng)靈敏，皮毛干凈光滑，飲食、二便正常。隨著跑臺訓(xùn)練強(qiáng)度的增加，大鼠逐漸出現(xiàn)了神情倦怠，反應(yīng)遲鈍，食欲降低，大便偏稀，體型瘦弱等疲勞癥狀。模型組大鼠雙眼乏神，毛發(fā)枯槁，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，運(yùn)動能力明顯下降，不給予刺激時難以維持原強(qiáng)度運(yùn)動。治療組大鼠疲勞癥狀比模型組有所好轉(zhuǎn)。

表1顯示，實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8周后，模型組、治療1組、治療2組大鼠體重明顯低于正常組和正常刺激組，治療組1組與2組大鼠體重顯著高于模型組。

表1 各組大鼠體重變化比較

表2顯示，8周后，模型組、治療1組和治療2組大鼠骨骼肌NO、TNOS和iNOS含量顯著高于正常組和正常刺激組（P < 0.05）；治療1組和治療2組大鼠NO、TNOS和iNOS含量顯著低于模型組（P < 0.05）。

表2 各組大鼠骨骼肌NO、NOS含量比較

3 討論

運(yùn)動性疲勞可歸于中醫(yī)“虛損”的范疇，其病因病機(jī)主要與精氣耗傷有關(guān)。足三里為足陽明胃經(jīng)的“合穴”和“下合穴”，為補(bǔ)虛要穴，能促進(jìn)或增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。環(huán)跳穴是足少陽、太陽經(jīng)之交會穴。此兩經(jīng)與腰腿部關(guān)系最密切，《針灸甲乙經(jīng)》云：“利腰脅相引痛急，髀筋瘈，脛痛不可屈伸，痹不仁，環(huán)跳主之。”從解剖部位看，刺激環(huán)跳穴可刺激臀大肌、股方肌、股上皮神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、臀下神經(jīng)。故刺激環(huán)跳可改善下肢運(yùn)動和感覺功能，具有利腰腿、通經(jīng)絡(luò)之功效。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇足三里和環(huán)跳穴作為防治運(yùn)動性骨骼肌疲勞的穴位。

體重變化可以反映機(jī)體的營養(yǎng)和肌肉生長情況，在一定程度上反映訓(xùn)練大鼠疲勞模型的成功與否。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，訓(xùn)練后，模型組大鼠體重明顯下降，與正常組相比有顯著性差異。兩治療組大鼠體重雖然也較正常組大鼠低，但明顯高于模型組。這說明經(jīng)皮穴位電刺激足三里、環(huán)跳穴可以減緩大鼠體重下降，改善疲勞癥狀，在一定程度上有抗疲勞的作用。

研究表明過量運(yùn)動導(dǎo)致肌肉酸痛和最大肌力下降往往伴有肌肉內(nèi)NO顯著增多和DNA的損傷，NO是運(yùn)動中產(chǎn)生的一種不容忽視的自由基物質(zhì)［7-9］，此外，長期過度訓(xùn)練可導(dǎo)致大鼠心肌與血清iNOS活性升高，引起心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［10］。NOS是NO生成的催化酶，在骨骼肌急性損傷、慢性持續(xù)性勞損、自身免疫炎癥性疾病等應(yīng)激狀態(tài)下，骨骼肌iNOS表達(dá)明顯升高，NO合成過量，可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，直至細(xì)胞核酸的亞硝?；?、脫氨基、氧化、破壞DNA結(jié)構(gòu)等多種病理損傷［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大運(yùn)動量耐力訓(xùn)練大鼠腓腸肌NO、TNOS和iNOS水平顯著上升，與正常組相比有顯著性差異。而兩治療組，無論訓(xùn)練前還是訓(xùn)練后進(jìn)行干預(yù)，均能降低腓腸肌NO、TNOS和iNOS水平，與模型組相比有顯著性差異，說明TEAS可能通過抑制NO表達(dá)增多預(yù)防大運(yùn)動量耐力訓(xùn)練對大鼠骨骼肌的破壞作用。正常組與正常刺激組之間無顯著差異，表明TEAS對正常大鼠無明顯影響。

綜上所述，經(jīng)皮穴位電刺激大運(yùn)動量耐力訓(xùn)練大鼠足三里、環(huán)跳穴可以顯著降低其腓腸肌NO、TNOS、iNOS水平，防止因過度訓(xùn)練導(dǎo)致NO合成過量對骨骼肌細(xì)胞的損傷，進(jìn)而起到防治骨骼肌疲勞的作用。TEAS的無創(chuàng)性及數(shù)碼顯示功能確保了使用的客觀準(zhǔn)確和可重復(fù)性，有望在運(yùn)動性疲勞研究領(lǐng)域中進(jìn)一步加以研究應(yīng)用。

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