6周游泳訓練對注射D-半乳糖致衰老大鼠學習記憶能力及海馬區NGF及其下游信號分子表達的影響

劉濤 白石 胡海濤

1 西安體育學院運動人體科學系（西安 710068） 2 西安交通大學醫學院解剖與組織胚胎學系

衰老患者神經細胞凋亡可引起其學習記憶能力嚴重下降［1，2］，因此，減緩或阻止神經元凋亡是治療老年性疾病如阿爾茨海默氏病（Alzheimer’ s disease,AD)和帕金森氏病（Parkinson’s disease, PD）的重要手段。一些神經營養因子，如神經生長因子（NGF），通過與其相應受體結合能激活細胞存活通路，如磷脂酸肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K）信號通路，PI3-K通路的下游分子Akt（又稱蛋白激酶B）及B細胞淋巴癌/白血病 -2（B-cell lymphomia/leukemia-2，Bcl-2） 是 促細胞存活，阻止細胞凋亡的重要分子［3］。因此，通過促進腦內源性神經生長因子的表達，進而激活細胞存活通路，對受損神經元進行修復是目前治療老年性疾病的熱點研究之一。近年來國內外對長期適宜負荷運動（包括跑臺、轉籠或游泳運動）對大鼠腦內神經營養因子表達的影響進行了研究，結果表明長期適宜負荷的運動可使大鼠腦內神經生長因子（NGF）、腦源性神經生長因子（BDNF）等表達量顯著增加，同時大鼠的空間學習能力也加強［4，5］。但目前針對運動對衰老大鼠神經營養因子的表達及其下游信號通路影響的研究還較少，尤其是運動對衰老大鼠神經生長因子產生的誘導作用及其下游信號分子的影響機制還不明確，而針對中等負荷游泳訓練對D-半乳糖誘導的大鼠衰老模型的Akt信號通路上、下游分子影響的研究國內外尚未見報道。所以本研究通過注射D-半乳糖制作大鼠衰老模型，觀察6周中等負荷游泳訓練后衰老大鼠的行為學特征、海馬神經元凋亡情況及腦內NGF及其下游Akt信號分子的表達，探討運動訓練對衰老大鼠腦功能影響的機制，為運動延緩衰老和防治老年性疾病的機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性2月齡SD大鼠30只，體重213±14g，由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供，許可證號SCXK（陜）2007-003。國家標準嚙齒類動物飼料喂養，自由飲食飲水。動物飼養環境室溫（23±1）℃，濕度45%～75%，自然光照。大鼠游泳池為90 cm×70 cm×60 cm的透明玻璃器皿，水深50 cm，水溫（33±1）℃。實驗前，隨機將大鼠分為正常對照組（normal control group，NC組）、衰老模型對照組（aging control group，AC組）、衰老模型訓練組（aging exercise group，AE組）3組，每組10只。

1.2 動物模型的建立

正常對照組（NC組）按常規飼養，自由活動，每日在頸背皮下注射1次生理鹽水（125 mg/kg），共6周。衰老模型對照組（AC組）常規喂養，自由活動，每日在頸背皮下注射1次D-半乳糖（125 mg/kg），共6周。衰老模型訓練組（AE組）常規喂養，每日在頸背皮下注射D-半乳糖（125 mg/kg），共6周［6］，并從第1周開始無負重游泳訓練，第1天游泳30 min，以后每天增加10 min，直至90 min后保持不變，每周訓練5天，周四、周日休息，共訓練6周。每次訓練結束后，動物均能自己抖干身上的水，無疲勞癥狀出現。

1.3 大鼠行為學測試

第7周，采用Morris水迷宮（荷蘭NOLDUS公司ETHOVISON軌跡記錄分析系統）對3組大鼠進行定位航行和空間探索行為實驗，判斷其學習記憶和空間記憶的認知能力。①定位航行實驗：共5天，將大鼠從標記的4個入水點依次朝向池壁輕輕放入水中，記錄大鼠在120s內尋找并爬上平臺所用時間，即逃避潛伏期。②空間探索實驗：在定位航行實驗結束后即第6天進行，撤除平臺，將大鼠放入水池，記錄大鼠在120s內穿越平臺所在區域的次數。行為學測試結束后，AE組有2只死亡，剩8只大鼠。

1.4 海馬CA3區TUNEL染色

水迷宮測試全部結束后24 h，各組隨機取3只進行TUNEL染色。大鼠經腹腔注射2%戊巴比妥鈉（60 mg/kg），經升主動脈灌注肝素化生理鹽水150 ml，4%多聚甲醛400 ml灌注。參照大鼠腦立體定位圖譜，切取左側海馬置于4%多聚甲醛溶液中后固定24 h，常規石蠟包埋。取石蠟切片冠狀面連續切片（厚5 μm），切片放入60℃烤箱烤12 h。切片脫蠟至水，PBS漂洗5 min×2次，2%蛋白酶K 50μl室溫孵育30 min，PBS漂洗5 min×2次，3% H2O2室溫下封閉 10 min，PBS漂洗 5 min×2次，濾紙吸干；加50 μl TdT反應液37℃避光反應60 min；PBS漂洗5 min×3次，濾紙吸干；加50 μl Streptavidin-HRP工作液，37℃避光反應30 min；PBS漂洗5 min×3次，加TUNEL染液，每片加50μl，37℃避光反應45 min；PBS漂洗5 min×3次，熒光封片液封片，蓋上蓋玻片，指甲油封好蓋玻片，倒置熒光顯微鏡（Olympus，Japan）下觀察計數。細胞質被染成綠色熒光的細胞為凋亡細胞。對各組每張切片分別取5個視野進行凋亡細胞計數，取平均值，熒光顯微鏡拍照。TUNEL檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司。

1.5 Western Blot 檢測

3組大鼠隨機各取5只，用10%水合氯醛腹腔麻醉，立即斷頭取腦。切取海馬置于預冷的細胞裂解液中充分勻漿后冰上靜置30 min；沸水中煮5 min；冰上冷卻5 min；以12000g轉速于4℃離心30 min；棄沉淀，留上清液。取小部分上清液用BCA法測定蛋白濃度，剩余上清液分裝，置-80 ℃冰箱待用。等量蛋白樣品（50 μg）經12.5% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜上。經5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別用兔多抗NGF（1:1000，Santa Cruz）、兔多抗 Phospho-Akt（Ser473）、Akt（1:2000，Cell Signaling Technology）、兔多抗 Bcl-2、Bax（1:500，Santa Cruz）及兔單抗-action（1:1000，Santa Cruz）室溫孵育1 h后，4℃過夜；TBST洗膜10 min ×3次，分別加入相應的HRP結合的羊抗兔IgG（1:2000，Pierce）室溫孵育1 h；TBST洗10 min ×3次，加入ECL發光液1 min后于暗室內進行膠片曝光、顯影、定影、晾干。實驗重復3次，-actin作為內參照。以目的條帶與內參的吸光度比值表示蛋白表達。應用Bandscan.5.0進行分析。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠行為學測試結果

表1顯示，各組大鼠在5天的游泳訓練中對尋找平臺均有一定的學習記憶能力，隨著訓練時間延長，大鼠逃避潛伏期逐漸縮短。從第3天開始，與NC組相比，AC組大鼠逃避潛伏期顯著延長（P <0.01），與AC組相比，訓練第4天、第5天AE組大鼠逃避潛伏期顯著縮短（P < 0.01）。

表1 定位航行試驗中三組大鼠逃避潛伏期比較（s）

空間探索試驗中，NC組、AC組和AE組跨越平臺次數分別為10.79±1.21、5.93±0.94與8.48±0.82。經雙因素方差分析，與NC組比較，AC組大鼠跨越平臺次數明顯降低（P < 0.01）；與AC組比較，AE組大鼠跨越平臺次數明顯增加（P < 0.01）。

2.2 大鼠海馬CA3區TUNEL染色結果

圖1顯示：NC組海馬CA3區凋亡細胞少，AC組綠色熒光強度明顯增強。表2顯示，與NC組比較，AC組海馬CA3區凋亡細胞數顯著增加（P< 0.01），AE組顯著少于AC組（P < 0.01）。

2.3 Western Blot 檢測結果

圖2～圖4顯示，與NC組比較，AC組NGF、P-Akt和Bcl-2蛋白表達明顯降低（P < 0.01）；與AC組相比，AE組NGF、P-Akt和Bcl-2蛋白表達明顯增加（P < 0.01）。3組Akt表達無明顯差異（P> 0.05）；與NC組比較，AC組Bax蛋白表達顯著增加（P < 0.01），與AC組相比，AE組Bax蛋白表達顯著減少（P < 0.01）。

表2 3組大鼠海馬神經元凋亡細胞數（n = 3）

3 討論

注射D-半乳糖致亞急性衰老大鼠模型是抗衰老研究的較好模型之一［7］。青年大鼠長期注射D-半乳糖后由于其代謝產物半乳糖醇不能被進一步代謝而堆積在細胞內，影響滲透壓，導致細胞腫脹，代謝紊亂，體內活性氧水平升高，細胞膜脂質受損，以致產生機體多器官、多系統的功能衰退，這些變化和自然衰老的變化一致。Morris水迷宮是通過讓實驗動物學習在水中尋找隱藏平臺并通過分析其尋找平臺所用時間和所走路徑測試實驗動物對空間位置覺和方向覺（空間定位）的學習記憶能力，進而判斷實驗動物記憶功能好壞的一種行為學測試方法。本實驗結果顯示，與正常對照組相比，注射D-半乳糖所致衰老大鼠逃避潛伏期明顯延長，跨越平臺次數明顯減少，說明在本實驗中，注射D-半乳糖可致大鼠學習記憶能力明顯下降。而與安靜衰老大鼠比較，經6周游泳訓練的衰老大鼠逃避潛伏期明顯縮短，跨越平臺次數明顯增加，差異有統計學意義，表明6周游泳負荷訓練可以提高衰老大鼠的空間學習記憶能力。這些結果與文獻報道［6，8，9］一致，因此長期適宜的體力活動可以改善衰老引起的認知功能低下和學習記憶能力降低。

海馬是與學習記憶關系最密切的解剖結構。衰老的病理變化主要表現為廣泛的大腦皮層神經元喪失，尤其是海馬和基底前腦膽堿能神經元發生退化［10］。神經細胞在衰老過程中的死亡主要是以凋亡形式發生的，神經元凋亡導致的突觸丟失是記憶功能障礙最主要的原因。本實驗結果表明，注射D-半乳糖可引起大量海馬神經元凋亡，而6周游泳訓練可減少D-半乳糖引起的大鼠海馬神經元凋亡，表現為TUNEL陽性細胞數明顯減少，說明6周的游泳訓練對海馬神經元具有保護作用。Chae等［11］研究指出，8周中等負荷跑臺訓練可有效降低海馬神經元凋亡率。而田野等［12］提出，過度負荷游泳訓練可使大鼠海馬神經元的細胞形態及超微結構發生損傷性改變。這說明運動負荷的控制對其影響海馬神經元是一個關鍵。

已有文獻報道，NGF可促進膽堿能神經元生長、分化和生存。外源性NGF可恢復因年齡因素引起的膽堿能神經元的損害，從而改善衰老大鼠的記憶［13，14］。本實驗結果顯示，與正常對照組相比，衰老大鼠海馬神經元NGF表達明顯降低，而6周游泳訓練可明顯增加衰老大鼠NGF表達量，說明6周游泳訓練可增加本實驗衰老大鼠海馬內源性NGF表達。Chae等［15］對糖尿病大鼠進行中等負荷的跑臺訓練后發現大鼠腦內NGF表達明顯增加。Neeper等［16］研究結果表明在7天自愿轉籠運動后大鼠海馬NGF表達迅速顯著增加。以上研究表明，NGF變化與運動刺激密切相關，適宜負荷的運動可以增加NGF分泌，促進受損神經元功能的恢復。NGF等生長因子與其細胞膜表面相應受體結合后可以激活一些細胞信號傳導通路，PI3-K/Akt信號通路是其中之一。PI3-K被NGF等胞外信號活化后，激活下游蛋白激酶Akt，活化的Akt可促進凋亡基因失活，從而抑制神經元凋亡以及促進神經元的存活［17］。Vaillant等［18］發現 Akt能維持 NGF 誘導的交感神經元的存活。本實驗觀察到AC組海馬神經元P-Akt表達明顯低于NC組，6周游泳訓練后AE組P-Akt表達明顯高于AC組，這說明6周游泳訓練可以提高衰老大鼠海馬神經元磷酸化Akt水平，已有研究［17，19］表明，Akt只有在磷酸化狀態下才能發揮其活性作用。而本實驗中3組海馬神經元非磷酸化Akt表達無顯著性差異。丁樹哲等［20］研究指出，耐力訓練可以增加衰老小鼠心肌Akt mRNA表達，從而提高衰老小鼠心肌細胞蛋白合成效率。Chen［21］等對大鼠進行2周的自愿轉籠運動訓練后發現，伴隨著BDNF表達的增加，磷酸化Akt表達也增加。

Bcl-2是Akt信號通路的下游分子之一。關于運動對Bcl-2家族蛋白影響的研究較多，Kang等［22］指出16周的跑臺訓練可上調AD模型大鼠腦內Bcl-2的表達，并下調Bax的表達。張鈞等［23］指出長期中等強度訓練可提高大鼠心肌中Bcl-2 mRNA的表達。本實驗中，6周游泳訓練明顯提高衰老大鼠海馬Bcl-2表達水平，同時降低Bax表達。我們認為其機制可能是6周的游泳訓練增加了大鼠內源性NGF表達，增加的NGF與其相應受體結合后激活細胞存活通路PI3k/Akt，活化的Akt磷酸化Bad，進而增加Bcl-2表達，同時抑制Bax表達，起到抑制海馬神經元凋亡的作用。

4 總結

注射D-半乳糖誘導的衰老模型大鼠進行6周游泳訓練后，其逃避潛伏期明顯縮短，跨越平臺次數明顯增加，同時海馬神經元凋亡明顯改善，可能是運動通過增加大鼠海馬內源性NGF產生，激活PI3K/Akt通路，導致Bcl-2蛋白表達增加，降低Bax表達，從而促進神經元存活。

［1］Mattson MP. Pathways towards and away from Alzheimer，s disease. Nature，2004，430，631-639.

［2］Betarbet R，Sherer TB，MacKenzie G，et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nat Neurosci，2000，3（12）：1301-1306.

［3］Rodgers EE，Theibert AB. Functions of PI 3-kinase in development of the nervous system. Int J Dev Neurosci，2002，20（3-5）：187-197.

［4］Cechetti F，Fochesatto C，Scopel D，et al. Effect of a neuroprotective exercise protocol on oxidative state and BDNF levels in the rat hippocampus. Brain Res，2008，1188：182-188.

［5］劉曉莉，李紅，喬德才. 適量運動對大鼠海馬神經元腦源性神經營養因子表達的影響. 沈陽體育學院學報，2008，27（3）：5-6，21.

［6］黨勝利，白石. 中等負荷跑臺訓練對D-半乳糖致衰老大鼠基底前腦-皮質自由基代謝的影響. 西安體育學院學報，2009，26（3）：347-350.

［7］徐智，吳國明，錢桂生. 大鼠衰老模型的初步建立.第三軍醫大學學報，2003，25（4）：312-315.

［8］田蘇平，陳海鷹，陳啟盛. 游泳應激對衰老小鼠學習記憶及腦內脂褐素含量的影響. 南京醫科大學學報，1998，18（3）：37-39.

［9］Radak Z，Kaneko T，Tahara S，et al. Regular exercise improves cognitive function and decreases oxidative damage in rat brain. Neurochem Int，2001，38（1）：17-23.

［10］Perez CA，Cancela CJM. Benefits of physical exercise for older adults with Alzheimer’s disease. Geriatr Nurs，2008，29（6）：384-391.

［11］Chae CH，Kim HT. Forced，moderate-intensity treadmill exercise suppresses apoptosis by increasing the level of NGF and stimulating phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the hippocampus of induced aging rats. Neurochem Int，2009，55（4）：208-213.

［12］滿君，田野，高頎. 過度運動對海馬神經元形態及腦源性神經營養因子表達的影響. 中國運動醫學雜志，2004，23（5）：510-512.

［13］Jakubowska-Dogru E，Gumusbas U. Chronic intracerebroventricular NGF administration improves working memory in young adult memory de fi cient rats. Neurosci Lett，2005，382（1-2）：45-50.

［14］Pizzo DP，Thal LJ. Intraparenchymal nerve growth factor improves behavioral deficits while minimizing the adverse effects of intracerebroventricular delivery. Neuroscience，2004，124（4）：743-755.

［15］Chae CH，Jung SL，An SH，et al. Treadmill exercise improves cognitive function and facilitates nerve growth factor signaling by activating mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase1/2 in the streptozotocin-induced diabetic rat hippocampus. Neuroscience，2009，164（4）：1665-1673.

［16］Neeper SA，Gomez-Pinilla F，Choi J，et al. Physical activity increases mRNA for brain-derived neurotrophic factor and nerve growth factor in rat brain. Brain Res，1996，726（1-2）：49-56.

［17］Manning BD，Cantley LC. AKT/PKB signaling： navigating downstream. Cell，2007，129（7）：1261-1274.

［18］Vaillant AR，Mazzoni I，Tudan C，et al. Depolarization and neurotrophins converge on the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway to synergistically regulate neuronal survival. J Cell Biol，1999，146（5）：955-966.

［19］Burke RE. Inhibition of mitogen-activated protein kinase and stimulation of Akt kinase signaling pathways：Two approaches with therapeutic potential in the treatment of neurodegenerative disease. Pharmacol Ther，2007，114（3）：261-277.

［20］李欣，丁樹哲，盧健. 耐力訓練對衰老小鼠心肌Akt/mTOR信號通路的影響. 中國運動醫學雜志，2010，29（1）：38-41.

［21］Chen MJ，Russo-Neustadt AA. Exercise activates the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Brain Res Mol Brain Res，2005，135（1-2）：181-193.

［22］Um HS，Kang EB，Leem YH，et al. Exercise training acts as a therapeutic strategy for reduction of the pathogenic phenotypes for Alzheimer's disease in an NSE/APPsw-transgenic model. Int J Mol Med，2008，22（4）：529-539.

［23］張鈞，陳曉鶯，許豪文. 運動對心肌細胞中凋亡調控基因表達的影響. 體育科學，2005，25（8）：79-82.