耐力訓練對動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠主動脈NF-kB和MMP-9表達的影響

劉善云 何玉秀 張洪俠 馮紅 王洪濤 王敏 徐新女 王金環

1 天津體育學院健康與運動科學系（天津 300381） 2 河北師范大學體育學院 3 天津市第一中心醫院衛生部危重病急救醫學重點實驗室 4 天津中醫藥大學臨床實訓教學部

動脈粥樣硬化（AS）不穩定斑塊的破裂及隨后的血栓形成是導致臨床急性冠脈綜合征（ACS）的病理基礎，對其發生機制及干預措施的研究具有重要的臨床意義?；|金屬蛋白酶（MMPs）與AS斑塊的穩定性密切相關，在AS病變發展過程中起著重要作用［1］，而核因子-B（NF-B）可調控MMPs等炎癥因子的表達，在形成AS時，NF-B激活可上調MMP-9的表達，后者可促進血管基質降解和AS病變進展及斑塊破裂［2，3］。因此，抑制NF-B活化可有效減少或延緩AS的形成與發展。已有研究表明，有氧運動可通過改善血脂及抗氧化能力等機制而有效干預AS的形成［4］，并對實驗動物已經形成的AS起到減緩其病變進展的作用［5］。但運動是否通過影響主動脈NF-B活化而發揮其抗AS作用尚待深入探討。本實驗通過建立ApoE-/-小鼠AS模型，觀察耐力訓練對AS小鼠主動脈NF-B和MMP-9表達的影響，進一步闡明運動抗AS的作用與可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

8周齡雄性ApoE-/-小鼠36只，體重20～22克，購自北京大學醫學部實驗動物中心[合格證號：scxk（京）2006-2008]，二級條件飼養。將實驗動物隨機分為14周AS模型組（H組）、26周AS模型組（HH組）、14周造模+12周運動干預組（HE組），每組12只。均飼以高脂高膽固醇膳食（膽固醇0.15%，脂肪21%）［6］。另選取12只具有相同遺傳背景的8周齡C57BL/6J小鼠作為26周對照組（N組），飼以標準動物飼料。各組動物均自由飲食、飲水。實驗室環境溫度22～24℃，相對濕度50%，光照時間12小時/天。

1.2 運動方案

HE組小鼠從第15周開始在動物活動跑臺上進行耐力訓練，依據Fernando等的研究［7］，采用遞增運動強度和時間運動，由10 m/min、30 min/次漸增至13 m/min、60 min/次（運動強度約相當于75%最大攝氧量），5次/周，共12周。每周測量小鼠體重，觀察其生長狀況及對運動負荷的適應能力等。

1.3 取材及標本處理

14周后處死H組小鼠以觀察AS模型是否成功建立，其余各組繼續進行12周實驗，至26周處死HH、HE、N組小鼠。取材前禁食12小時，HE組停止運動24小時，以消除最后一次運動的急性影響。采取腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，眼球摘除法取血。取血后迅速打開胸腔，暴露心臟和主動脈，采用常規方法進行灌注和沖洗后，取出全心臟（包括主動脈弓），分離主動脈并剔除血管外附著組織后，置于4%多聚甲醛中固定4小時以上。將心臟及主動脈近心端1～1.5 cm組織用OCT包埋后-20℃冰箱保存，以制備主動脈冰凍切片。

采用BLATER冰凍切片機（ATTENPON公司），參照Suzuki等的方法［8］，自小鼠心底部開始作橫斷面連續切片。從主動脈瓣尖出現起連續橫切，在顯微鏡下選取切片（主動脈橫斷面出現3個主動脈瓣尖時起至瓣尖消失），切片厚7 μm。每隔10張取1張，分別用于主動脈病理觀察和NF-B及MMP-9表達的測定。

1.4 主動脈病理及組織形態學觀察

取各組小鼠主動脈冰凍切片，行HE染色，光鏡下觀察其組織形態學特征及病理變化。

1.5 主動脈NF-kB mRNA表達及NF-kBp65和MMP-9蛋白表達的測定

1.6 統計學分析

實驗數據采用統計軟件SPSS 11.5進行統計處理，結果以均值±標準差（± s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，顯著性水平為P < 0.05和P < 0.01。

2 結果

2.1 各組小鼠主動脈形態學變化

圖1顯示，H組小鼠主動脈內膜明顯增厚，可見由大量泡沫細胞形成的脂紋期病變和纖維斑塊期病變。

如圖2所示，與H組相比，HH組（34周齡）小鼠主動脈病變明顯加重，動脈內膜斑塊較厚，泡沫細胞及膽固醇結晶（針狀空隙）較多，局部呈玻璃樣變性，可見大量炎性細胞浸潤、聚集，脂質核心較大，顯示出易損斑塊的特征。與HH組相比，HE組小鼠主動脈AS病變程度相對較輕，尚未見到明顯的膽固醇結晶和易損斑塊的特征。

2.2 各組小鼠主動脈NF-kB mRNA及NF-kBp65陽性細胞%

表1 各組小鼠主動脈NF-B表達

表1 各組小鼠主動脈NF-B表達

注：** P < 0.01：與N組比較；## P < 0.01：與HH組比較。

2.3 各組小鼠主動脈MMP-9陽性細胞%

圖4和表2顯示，與正常對照組比較，HH組MMP-9陽性顆粒明顯增多，其陽性細胞百分比顯著高于對照組（P < 0.01），而HE組顯著低于HH組（P < 0.01），這提示AS小鼠主動脈MMP-9表達較高，而12周耐力訓練能有效降低其表達量。

表2 各組小鼠主動脈MMP-9表達

3 討論

本實驗結果顯示，22周齡ApoE-/-小鼠已發生典型AS病變。繼續飼養12周至34周齡時ApoE-/-小鼠主動脈AS病變明顯加重，AS斑塊明顯增厚，可見大量的膽固醇結晶和炎性細胞浸潤，部分樣本呈現出易損斑塊的特征，其病理形態學觀察結果與近期研究報道一致［5］。與AS模型組相比，運動組小鼠AS病變程度明顯減輕，表明12周耐力訓練雖未逆轉ApoE-/-小鼠已形成的AS病變，但能有效延緩AS病變的進展，從而發揮抗AS作用。

臨床資料顯示：60～75%ACS由AS斑塊破裂繼發血栓引起，AS不穩定斑塊是心腦血管疾病的高危因素。因此，如何穩定AS斑塊成為目前心血管疾病防治研究的熱點。研究證實，MMPs與AS斑塊穩定性密切相關，其中MMP-9在細胞外基質降解過程中起著關鍵作用，在AS不穩定斑塊，尤其易發生破裂的斑塊肩部區域MMP-9表達增高是導致斑塊不穩定并形成血栓的重要原因［2］。而適度抑制MMP-9活性可提高AS斑塊穩定性，有助于減少斑塊破裂的發生［11］。本研究結果顯示，在已形成AS的34周齡ApoE-/-小鼠動脈組織及斑塊中MMP-9陽性細胞率明顯增加，表明AS發生與MMP-9表達增加有關。12周運動干預能使主動脈MMP-9表達顯著降低，其AS病變程度也較模型組明顯減輕，說明運動可能通過下調MMP-9表達而減緩AS病變進展，并對AS斑塊穩定性起到有益作用。

4 總結

耐力訓練降低ApoE-/-小鼠主動脈NF-Bp65及其mRNA表達，下調MMP-9表達，從而發揮抗AS作用，可能是運動防治AS的機制之一。

［1］Galis ZS，Khatri JJ. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and therosclerosis： the good，the bad，and the ugly. Circ Res，2002，90（8）：251-262.

［2］Ferroni P，Basili S，Martini F，et al. Serum metalloproteinase 9 levels in patients with coronary artery disease：a novel marker of in fl ammation. J Investing Med，2003，51（5）：295-300.

［3］Luttun A，Lutgens E，Manderveld A，et al. Loss of matrix metalloproteinase-9 or matrix metalloproteinase-12 protects apolipoprotein e-deficient mice against atherosclerotic media destruction but differentially affects plaque growth. Circulation，2004，109：1408-1414.

［4］Marianne Pynn，Katrin Sch?fer，Stavros Konstan-tinides，et al. Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein E–de fi cient mice. Circulation，2004，109（3）：386-392.

［5］劉善云，何玉秀，張洪俠，等. 耐力訓練對ApoE-/-小鼠AS形成及病理變化的干預作用研究.中國運動醫學雜志，2011，30（1）：41- 47.

［6］Shah PK，Jan Nilsson，Kaul S，et a1. Effects of recombinant apolipoprotein a-I（Milano） on aortic atherosclerosis in apolipoprotein E-de fi cient mice. Circulation，1998，97（8）：780-785.

［7］Fernando P，Bonen A，Hoffman Goetz L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol，1993，71（10）：854-857.

［8］Suzuki H. Kurihara Y. Takeya M. et a1. A Role for macrophage scavenger receptors in atherosclerosis and susceptihility to infection. Nature，1997，386（6622）：292-296.

［9］Hameed O，Chhieng DC，Adams AL，et al. Does using a higher cutoff for the percentage of positive cells improve the specificity of HER-2 immunohistochemical analysis in breast carcinoma? Am J Clin Pathol，2007，128（5）：825-829.

［10］許良中，楊文濤. 免疫組織化學反應結果的判定標準.中國癌癥雜志，1996，6（4）：229-231.

［11］Johnson C，Galis ZS. Matrix metalloproteinase-2 and-9 differentially regulate smooth muscle cell migration and cell—mediated collagen organization. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24 ：54-60.

［12］史立宏，王守訓，高爾. 核因子-B的活性與動脈粥樣硬化啟動. 中國病理生理雜志，2003，110（19）：1527-1531.

［13］Chase AJ，Bond M，Crook MF，et al. Role of nuclear factor kappa B activation in metallopmteinase-1，3，and-9 secretion by human maerophages in vitro and rabbit foam cells produced in vivo. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22（8）：765-771.

［14］鄭廣娟，張文高，劉龍濤，等. 脈心康對載脂蛋白E基因敲除小鼠核因子-B和基質金屬蛋白酶9表達的調控. 中國動脈硬化雜志，2006，14（5）：444-445.

［15］華先平，孔祥輝，杜令，等. 氯吡格雷對兔動脈粥樣硬化基質金屬蛋白酶-9及血管壁核因子-B表達的影響. 臨床心血管病雜志，2007，23（6）：464-467.