銀杏葉口服液微生物限度檢查試驗及方法學驗證資料

朱曉燕

（哈藥集團三精制藥股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150000）

微生物限度檢查法

取銀杏葉口服液3支（規格：10ml）,共取10ml供試品，至90mlPH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，制成 1：10、1：100、1：1000 供試液備用。

細菌數 取1：10供試液50ml用薄膜過濾法過濾。用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜,每次沖洗100ml,共沖洗三次.沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營養瓊脂培養基平板上培養.若濾膜上無菌落生長,以<1乘以稀釋倍數報告菌數.

霉菌數 取各稀釋級供試液1ml，采用平皿法，依法《中國藥典》2005年版一部附錄檢查，應符合規定。

控制菌取1：10供試液10ml（相當于供試品1ml）接種至100 ml相應培養基中，培養18-24小時。依《中國藥典》2005年版一部附錄檢驗，結果應符合規定。

微生物限度檢查方法學驗證

依據《中國藥典》2005年版，對銀杏葉口服液的微生物限度檢查法進行了方法學驗證，驗證結果如下：

1 樣品：銀杏葉口服液

批號：10042114、10042124、10042134

生產單位：哈藥集團三精制藥股份有限公司

2 驗證用菌種：

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]

白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC(F)98001]

黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]

3 驗證用培養基：

營養瓊脂培養基 批號：090225

玫瑰紅鈉瓊脂培養基 批號：080905

膽鹽乳糖培養基 批號：090104

營養肉湯培養基 批號：090121

改良馬丁培養基 批號：090220

曙紅亞甲藍培養基 批號：090322

以上培養基均由中檢所提供。

4 菌液制備：

4.1 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，培養18-24小時；

接種白色念珠菌至改良馬丁培養基中，培養24-48小時。

以上菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成50-100CFU/ml的菌懸液，并同時進行活菌計數。

4.2 接種黑曲霉至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，培養5-7天。用氯化鈉溶液3-5ml將黑曲霉孢子洗脫至無菌試管內，再用氯化鈉溶液制成50-100CFU/ml的孢子懸液，并同時進行活菌計數。

5 供試液制備：

取銀杏葉口服液3支，共取供試品10ml，至90mlPH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，制成1：10的供試液備用。(共制3份該供試液，分別供3種細菌試驗用)

6 方法學驗證試驗：

6.1 細菌計數方法驗證：

6.1.1 試驗組：

取1:10的供試液50ml用薄膜過濾法過濾。用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗100ml，共沖洗三次.在最后一次沖洗液中加入50-100cfu/ml試驗菌1ml，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養瓊脂培養基平板上培養，測定試驗組菌數。

6.1.2 菌液組：

取上述菌液1ml至平皿中，傾注營養瓊脂培養基，至相應的溫度培養。測定所加的試驗菌數。

6.1.3 供試品對照組：

取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

6.1.4 稀釋劑對照組：

用相應稀釋劑和沖洗液代替供試品，按試驗組的方法測定其菌數。

6.2 霉菌及酵母菌計數方法驗證：

6.2.1 試驗組：

取1：10供試液1ml于平皿中，再加入相應的陽性試驗菌菌液1ml，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置相應溫度培養，每株試驗菌平行制備二個平皿，測定其菌數。

6.2.2 菌液組：

取稀釋好的相應菌液1ml，方法同試驗組，分別加入平皿中，加入相應培養基，置相應溫度培養，測定所加的試驗菌數。

6.2.3 供試品對照組：

取規定量供試液，按菌落計數法測定供試品本底菌數。

6.2.4 稀釋劑對照組：

取稀釋劑替代供試液，方法同試驗組。

7 次驗證結果見表1，2，3

7.1 控制菌檢查方法驗證：

7.1.1 大腸埃希菌檢查方法驗證

菌種：

陽性菌：大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

陰性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

試驗方法：

7.1.2 試驗組：取1：10供試液10ml（相當于供試品1ml）及10-100cfu試驗菌接種至膽鹽乳糖培養基100 ml中，培養18-24小時。依《中國藥典》2005年版一部附錄檢驗。

7.1.3 陰性對照組：方法同試驗組，加入1ml 10-100cfu陰性菌。

8 次驗證結果見表4，5，6

8.1 結果：

8.1.1 計數方法驗證：在三次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率均大于70%，試驗組的菌回收率均大于70%。故可照該供試液制備法和計數法，測定銀杏葉口服液的細菌數、霉菌數及酵母菌數。

a.制菌檢查法驗證：陰性對照組未檢出陰性對照菌，試驗組檢出陽性試驗菌，故可以照此供試液制備法和控制菌檢查法進行銀杏葉口服液的控制菌檢查。

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[1]宋勤,杜平華.中成藥微生物限度檢查方法的探討[J].中國藥事，2006-01-20.