影響美洲大蠊藥材中游離氨基酸測定的因素研究

王加黨，李艷玲，賀永梅，孫曉梅，楊永壽

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

影響美洲大蠊藥材中游離氨基酸測定的因素研究

王加黨，李艷玲，賀永梅，孫曉梅，楊永壽*

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

目的：研究影響美洲大蠊藥材中游離氨基酸含量測定的各因素，確定最佳檢測條件。方法：采用單因素實驗和正交設計實驗，對溶劑濃度、物料比、提取時間、提取次數、活性炭用量、脫色時間、緩沖溶液的pH值、顯色時間進行考察。結果：美洲大蠊藥材中游離氨基酸的最佳提取條件為：8倍量65%乙醇，回流提取3次，每次60 min；最佳測定條件為：脫色時活性炭和樣品的比例為4∶100，脫色時間10 min，顯色時緩沖溶液的pH=6.0，水浴加熱顯色30 min。結論：該提取條件和測量方法適用于美洲大蠊中游離氨基酸的含量測定。

美洲大蠊；游離氨基酸；含量測定；影響因素

美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus）為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲〔1〕，俗稱“蟑螂”、“偷油郎”，是世界上最古老、生命力最強的昆蟲之一。主要分布在熱帶和亞熱帶地區，喜歡陰暗潮濕、溫暖的環境。因其對病菌的傳播，故被列為世界性衛生害蟲〔2〕。但近年來的研究表明，美洲大蠊具有較高的藥用價值〔3-7〕。在我國，美洲大蠊作為藥用昆蟲最早載于《神農本草經》，美洲大蠊性寒，味咸，治血瘀癥堅寒熱、破積聚、喉咽閉、內寒無子等癥〔8〕，具有破瘀化積、消腫、解毒、通利血脈之功效，常用于治療小兒瘡積、疔瘡、喉蛾、無名腫毒等。我國科學工作者經過多年的研究，發現美洲大蠊體內含有活性很強的化學物質，并研發出“康復新液”、“肝龍膠囊”、“新脈隆注射液”等藥物。美洲大蠊藥材現行質量標準為云南省地方標準，其含量測定指標為游離氨基酸，但在長期的實驗過程中發現，美洲大蠊中游離氨基酸測定方法中每一個影響因素的改變對實驗結果的影響都非常大，為了保證測定結果的準確性，我們采用單因素試驗對乙醇濃度、脫色時活性炭的用量、脫色時間、緩沖溶液的pH值、加熱顯色時間進行考察，采用正交試驗對藥材中游離氨基酸的提取時間、提取次數、料液比進行考察，以便進一步完善美洲大蠊的質量標準。

1 材料與儀器

1.1材料美洲大蠊藥材購于大理州彌渡縣養殖場，酪氨酸對照品購于中國藥品生物制品鑒定所（批號：110821-200609），水為超純水，其它試劑均為分析純。

1.2儀器TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、梅特勒電子天平AE240（梅特勒儀器有限公司）、DZKW-4電子恒溫水浴鍋（上海科析實驗儀器廠）、超聲波清洗器（上海科導超聲儀器公司）、RE-3000旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、FYB5型萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限責任公司）、LD4-2型離心機（北京醫用離心機廠）、pHS-25C型數字酸度計（梅特勒儀器有限公司）。

2 方法

2.1樣品提取取粉碎后過50目篩的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，加一定濃度的乙醇按實驗方案進行回流提取，過濾，合并濾液，減壓濃縮得浸膏，浸膏加約40 mL沸水加熱溶解，靜置放冷、過濾，除去脂肪層，濾液于50 mL比色管中加蒸餾水定容，加活性炭0.4 g，振搖、靜置、過濾，濾液即為供試品溶液。

2.2對照品溶液的配制（50.00μg/mL）精密稱取80℃干燥至恒重的酪氨酸對照品5.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加0.02 mol/L的NaOH溶液10 mL于沸水浴中加熱至完全溶解，冷卻至室溫，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得。

2.3檸檬酸鹽緩沖溶液的配置精密稱取21.0 g檸檬酸于燒杯中，加200 mL蒸餾水使其充分溶解，滴加1 mol/L的NaOH溶液調pH至試驗所需pH值，轉移至500 mL量瓶中用蒸餾水定容，搖勻，即得。分別配置pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的檸檬酸鹽緩沖液，備用。

2.4標準曲線的繪制精密吸取“2.2”項中制備好的酪氨酸溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，分別加入1 mL檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）和1 mL 1.0%的茚三酮乙醇溶液，搖勻，水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，分別加入60%乙醇3 mL，蒸餾水定容，搖勻，照中國藥典附錄中分光光度法于570 nm〔9〕處測定吸光度A。以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：A=0.004 9C-0.241 2，r=0.999 9，結果表明酪氨酸含量在50~250μg范圍之間呈良好的線性關系。

2.5供試品中總氨基酸的含量測定精密吸取供試品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，照“標準曲線制備”項下的方法自“分別加入1 mL檸檬酸緩沖液”起，依法測定吸光度，用標準曲線法計算出供試品溶液中總氨基酸的含量（μg），并照下列公式換算為美洲大蠊中總氨基酸的含量：

總氨基酸（mg/g）=（C×2.5×0.662）÷W

W為供試品重量（g）；C為氨基酸含量（μg）；2.5為溶液的稀釋倍數；轉換系數0.662是氨基酸的平均分子量120除以酪氨酸的分子量181.2所得。

3 單因素試驗

3.1乙醇濃度的考察〔10〕取粉碎后過50目篩的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，按“表1”分別加入95%、85%、75%、65%、55%、45%的乙醇溶液回流提取1.5 h，按“2.1”項進行提取，按“2.5”項進行測定、計算，結果見表1。

表1 提取溶劑濃度考察結果

從表1結果可知，用65%的乙醇作提取溶劑效果最好，故實驗中采用65%的乙醇作提取溶劑。

3.2脫色時活性炭用量選擇〔11〕取粉碎后過50目篩的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，用65%的乙醇回流提取1.5 h后，除加入活性炭的量按“表2”要求外，其它操作按“2.1”項進行提取，按“2.5”項進行測定、計算，結果見表2。

表2 活性炭比例考察

從表2結果可知，藥材與活性炭的比例為100∶4或100∶5實驗結果都較好，故本實驗采用100∶4的活性炭進行脫色。

3.3脫色時間的選擇〔11〕取粉碎后過50目篩的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，用65%的乙醇回流提取1.5 h后，除脫色時間按“表3”要求進行外，其它操作按“2.1”項進行提取，按“2.5”項進行測定、計算，結果見表3。

表3 脫色時間的考察

從表3結果可知，加活性炭脫色，脫色時間大于10 min對試驗結果無顯著影響，為了使試驗更方便，故本實驗脫色時間選用10 min。

3.4緩沖溶液pH值的選擇精密吸取“2.1”項中制備好的樣品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按“2.5”項進行測定、計算，顯色時緩沖溶液的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。結果見表4。

表4 緩沖溶液pH值的考察

由表4結果可知，顯色時溶液的pH值為6.0時測量結果最高，故確定緩沖溶液pH值為6.0。

3.5顯色時間的選擇〔12〕精密吸取“2.2”項中制備好的酪氨酸對照品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按“2.5”項進行測定、計算，顯色時間和測定結果見表5。

表5 顯色時間的考察

由表5結果可知，顯色時間為30、40、50 min時測量結果都高，但30 min時測量結果較高一些，故確定顯色時間為30 min。

4 正交試驗

4.1提取條件的選擇〔13-15〕為了優化提取工藝，根據美洲大蠊藥材在提取過程中的影響因素，在單因素試驗的基礎上考慮提取時間、提取次數、物料比三個因素進行L9（33）正交試驗，結果見表6。取粉碎后過50目篩的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，用65%的乙醇按照“表6”和“表7”正交試驗方案進行回流提取，之后，按“2.5”項進行測定、計算。以總氨基酸含量為考察指標，結果見表7。

表6 因素水平

表7 L9（33）正交實驗設計以及結果

正交試驗結果的直觀分析和方差分析表明：這三個因素對試驗結果的影響次序為B>A>C，且三個因素對試驗都有顯著影響。從而可確定最優工藝為A3B3C1，即溶劑用量8倍，提取3次，每次3 h。但因考慮工廠實際生產以及該實驗條件對測量結果的影響大小，故可確定最佳組合為A1B3C1，即最優工藝為：8倍量溶劑提取3次，每次1 h。結果見表8。

表8 方差分析表

4.2正交試驗結果驗證為驗證由正交試驗優選而得的最佳條件A1B3C1（即8倍量溶劑提取3次，每次1 h）組合的正確性，按此組合做3次平行實驗，得該批美洲大蠊藥材中游離氨基酸的含量為28.84 mg/g（RSD=1.03%），比任何一次試驗的含量都高。這就進一步證明A1B3C1提取效果最好，為最佳組合。即最優提取工藝為：8倍量溶劑提取3次，每次1 h。

5 結論

本試驗采用單因素實驗和正交設計實驗相結合，對影響美洲大蠊中游離氨基酸測定的各種因素進行研究，結果表明最佳提取條件為：8倍量65%乙醇，回流提取3次，每次60 min；最佳測定條件為：脫色時活性炭和樣品的比例為4∶100，脫色時間為10 min；顯色時緩沖溶液的pH為6.0，水浴加熱顯色30 min。

本試驗正交結果顯著性良好，該測定方法操作簡便，考察全面，為美洲大蠊中游離氨基酸的準確測定提供理論依據，另外還可為美洲大蠊藥材的進一步開發研究提供實驗基礎。

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*通信作者：楊永壽，高級實驗師.

（責任編輯 毛本勇）

Influence Factor Study of the Determination of Free Amino Acids in Periplaneta Americana Medicine

WANG Jiadang,LI Yanling,HE Yongmei,SUN Xiaomei,YANG Yongshou*
（School of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the influence factors of the determination of free amino acids in Periplaneta americana medicine and find out the best testing condition.Methods:Single factor experiment and orthogonal test design were applied to determine the solvent concentration,material ratio,extraction time,extraction times,active carbon dosage,decoloring time,pH value of the buffer solvent and coloring time.Results:The optimum extraction condition for free amino acids from the Periplaneta americana is that reflux extraction is applied to the 8 times of 65%ethanol for 3 times with each time lasting 60 minutes;the optimum testing condition lies when the ratio between active carbon and the sample is 4:100 in the 10 minutes'decolorization,and the pH value of the butter solvent is 6.0 in coloring and then water bath heating is applied for 30 minutes.Conclusion:The extraction and testing conditions are suitable for testing the amount of free amino acids in Periplaneta americana.

Periplaneta americana;free amino acids;content determination;influence factor

R284.2

A

1672-2345（2011）12-0012-04

國家自然科學基金項目（81060329）

2011-04-28

2011-08-30

王加黨，藥學專業本科生.