Aβ25-35致PC12細胞凋亡和線粒體跨膜電位損傷關系研究＊

張紅 劉劍 秦大蓮,2 章卓,2△

(1.瀘州醫學院藥學院藥理教研室,四川 瀘州 646000;2.藥品與功能食品研究中心,四川 瀘州 646000)

隨著老齡社會的到來,阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者越來越多。AD為慢性進行性神經變性疾病,以認知功能和記憶損害、日常生活能力進行性下降、神經心理癥狀和精神行為異常為主要特征。由于其涉及機制復雜,目前尚無有效手段治療。β-淀粉樣蛋白異常沉積、細胞凋亡在AD的發病中起著重要作用,β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)由 39-43個氨基酸組成,相對分子質量約為(4.0-4.2)×103,聚集態的Aβ25-35可以導致神經細胞凋亡,損傷神經細胞[1]。目前各實驗室對Aβ25-35致PC12細胞凋亡的最適濃度與最適時間各有不同,對Aβ25-35致 PC12細胞凋亡原因是否與改變線粒體跨膜電位有關也未見研究,據此本研究通過采用不同濃度的Aβ25-35在不同時間誘導PC細胞凋亡,確定Aβ25-35誘導PC細胞凋亡的最適濃度和最佳時間,并進一步分析其凋亡和線粒體跨膜電位(M TP)改變間關系,為建立阿爾茨海默病細胞模型,進一步闡明阿爾茨海默病的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Aβ25-35(北京奧普森有限公司);PC12細胞(購自武漢大學CCTCC細胞庫);Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Keygen公司,批號 20101202);Hoechst 33342以及 PI(Sigma,USA);DM EM/F12培養基,胎牛血清,馬血清(天津灝洋生物制品科技責任有限公司);CCK-8試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1.2 儀器

倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司,CKX41型);CO2培養箱(日本Sanyo公司,M CO-15AC型);超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司,SW-CJ-1F型);離心機(北京醫用離心機廠,LG10-3A型);電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司,FA1104N型);超低溫冰箱(日本Sanyo公司,MDF-192型);高壓消毒鍋(上海申安醫療器械廠,LDZX-40BI型);酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司,DNM-9602型);優普超純水機(成都超純科技有限公司,UPH-IV-10T型);激光共聚焦掃描顯微鏡(德國LEICA公司,TCS SP5型)。流式細胞儀(美國 BD公司,SBK-YLQX-003552型)。

1.3 Aβ25-35配制方法

將 Aβ25-35溶于超凈水,配成16000μmol? L-1母液分裝,-20℃凍存,使用前于37℃孵育 1 w,使其變為聚集狀態。

1.4 PC12細胞培養及分組

PC-12細胞株完全培養液為 DM EM+5%胎牛血清+10%馬血清+青鏈霉素,培養瓶多聚賴氨酸鋪底,5%CO237℃培養箱中培養。每3～4 d傳代1次。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。分組：①陰性組：不加任何處理因素。②實驗組：Aβ25-35按160,80,40,20,10,5,2.5μ mol?L-17個濃度進行處理,處理時間按6,12,24 h進行設計。

1.5 CCK-8法檢測細胞活性

取對數生長期的PC12細胞,0.25%胰酶制成單個細胞懸液,細胞濃度為1×105?L-1接種于 96孔板,每孔90 μ l,培養24 h待其貼壁后加藥。每孔加Aβ25-3510 μ l,每個濃度 4個復孔,Aβ25-35 終濃度分別為 160,80,40,20,10,5,2.5μmol?L-1,陰性組加等體積無血清 RPMI 1640,繼續培養6,12,24 h后,每孔加入CCK-810μ l繼續培養1 h,酶標儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值,以OD值反應細胞活力情況。

1.6 Annexin V-FITC流式細胞儀檢測PC12細胞凋亡

PC12細胞培養和處理同1.5。消化收集細胞,用冷PBS洗兩次,將細胞懸浮于AnnexinV混合緩沖液中(1×106?ml-1),取 100 μ l細 胞 懸液 至 EP 管 中,加 5 μ l Armexin-FITC和5 μ l PI,輕輕振搖細胞,室溫下于暗處放置15min,1 h內用流式細胞儀分析。

1.7 Hochest33342/PI雙染檢測PC12細胞凋亡

PC12細胞培養和處理同1.5。收集細胞懸浮于1mL培養基中,加入 10 μ l Hochest 33342儲存液(100 mg? L-1,蒸餾水溶解),染色15min;將細胞置于冰上冷卻后,離心,去上清,將細胞重懸于 1ml PBS中,加人5 μ l PI儲存液(1 g?L-1,蒸餾水溶解),混勻,熒光顯微鏡觀察。

1.8 羅丹明染色檢測線粒體跨膜電位

將不同處理后的 PC12細胞用 0.25%胰酶消化,收集1×l06個細胞,經 PBS 清洗 2 次,與 1μmol?L-1Rh123 在37℃共同孵育30min,PBS清洗2次,熒光顯微鏡下觀察。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度Aβ25-35在不同處理時間對 PC12細胞活力影響

同陰性對照組比較,Aβ25-35處理 6 h僅 160,80μmol?L-12個濃度組有差異,Aβ25-35處理 12 h和 24 h,Aβ25-3520μ mol?L-1以 上 組 均 有 統 計 學 意 義 (P＜0.05),10μ mol?L-1以下組處理 6,12,24 h后均無統計學意義(P＞0.05),見圖 1。

圖1 A β25-35不同濃度和不同處理時間對PC 12細胞活力影響

2.2 不同濃度Aβ25-35誘導PC12細胞12 h后凋亡率的變化

將流式細胞檢測的早期凋亡率與晚期凋亡率相加得到凋亡率。結果顯示,與陰性組比較,Aβ25-3520μmol?L-1以上組均有統計學意義(P＜0.05),但 160,80μmol?L-1晚期凋亡較多,見圖 2。

圖2 不同濃度 A β25-35刺激PC 12細胞12 h后凋亡率影響

2.3 不同濃度Aβ25-35誘導PC12細胞12 h后細胞形態變化

Hochest 33342/PI雙染顯示,陰性對照組細胞形態呈圓形,淡藍色,無凋亡細胞。Aβ25-3520μmol? L-1以上組細胞部分呈凋亡特征性改變,細胞核呈亮藍色染色,凋亡細胞較多。還可見死亡細胞(紅色),160,80μmol?L-1組死亡細胞多于其他各組,見圖3。

圖3 不同濃度A β25-35刺激PC 12細胞12 h后凋亡影響

2.5 對線粒體跨膜電位影響

熒光顯微鏡結果顯示,Aβ25-3520μmol?L-1以上組細胞熒光較強,線粒體跨膜電位降低。提示 Aβ25-3520μmol?L-1以上濃度可降低PC12細胞線粒體跨膜電位,與凋亡程度呈正相關,見圖4。

圖4 不同濃度 A β25-35刺激12 h對PC 12細胞線粒體跨膜電位影響

3 討論

Aβ25-35具有與Aβ全長片段相同的功能,研究顯示聚集態的Aβ25-35對神經細胞具有毒性作用,此作用可能與激活細胞外磷脂激酶A2依賴的信號調節途徑刺激ROS產物的生成損傷細胞器和細胞骨架有關;還可能通過影響 PI3K/Akt、JNK-CJun-FasL-Fas等信號通路導致細胞損傷[2]。

線粒體內膜兩側電子的不對稱分布造成線粒體跨膜電位(△ψm)。正常生理情況下,線粒體內膜通透性很低,僅允許不帶電荷的小分子物質通過,對離子(包括質子)幾乎不能透過內膜,某些大分子和離子要通過選擇性通道或轉運蛋白才能通過內膜。內膜的低通透性是維持電化學質子梯度、進行氧化磷酸化的結構基礎。線粒體通透性轉換孔(Mitochondrialpermeability transition pore,MPTP)開放致線粒體內膜通透性改變(Permeability transition,PT),線粒體內膜允許分子量115kDa的分子自由通過[3]。在細胞凋亡早期,線粒體外膜對蛋白質的通透性增高,線粒體內膜的跨膜潛能降低。當線粒體膜內外的電勢差減少時.線粒體膜電位降低,可引起線粒體膜內外一系列的生化改變,如釋放具有調控能量代謝和細胞凋亡雙重功能的Bcl-2家族及Caspase活化等,引起細胞凋亡的級聯反應.最終導致細胞凋亡[4]。羅丹明123(Rhodamine 123)是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料,其在正常細胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質,熒光強度減弱或消失。而在凋亡發生時,線粒體膜完整性破壞,線粒體膜通透性轉運孔開放,引起線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩潰,Rh123重新釋放出線粒體,從而發出強黃綠色熒光。本實驗選擇羅丹明染色后熒光顯微鏡檢測線粒體跨膜電位。

PC12細胞為大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞克隆化的細胞株,具有典型的神經內分泌細胞的特性,它廣泛應用于研究神經細胞分化、神經毒性等試驗。因此不少實驗室通過Aβ25-35刺激PC12細胞導致神經細胞凋亡建立阿爾茨海默病細胞模型,但目前各實驗室對Aβ25-35致PC12細胞凋亡的最適濃度與最適時間各有不同[5],對Aβ25-35致PC12細胞凋亡原因是否與改變線粒體跨膜電位有關也未見研究,據此本實驗室通過采用160,80,40,20,10,5,2.5μ mol?L-17個濃度的Aβ25-35在6,12,24h誘導PC細胞凋亡,確定Aβ25-35誘導PC細胞凋亡的最適濃度和最佳時間,并進一步分析其凋亡和線粒體跨膜電位改變間關系。實驗結果顯示,同正常組比較,Aβ25-3520μ mol?L-1以上濃度組刺激12 h即可出現細胞活力明顯下降,凋亡率明顯增加(P＜0.05),但160,80μmol?L-1晚期凋亡較多。熒光顯微鏡顯示細胞有核濃縮和凋亡小體的產生,甚至出現死亡現象,160,80μmol?L-1組死亡細胞多于其他各組。線粒體跨膜電位降低,與凋亡程度呈正相關。20μmol?L-1以下各濃度組對PC12細胞活力、細胞凋亡率、線粒體跨膜電位無明顯影響(P＞0.05)。

因此本實驗綜合凋亡結果、經濟性、時間等多種因素認為,20μ mol?L-1刺激12 h即可得到理想的 PC12細胞凋亡模型,既省錢又省時,為建立阿爾茨海默病細胞模型,進一步闡明阿爾茨海默病的分子機制奠定基礎。

1 孫治坤,潘靜,楊紅旗,等.PI3K/Akt途徑在Aβ25-35誘導細胞凋亡過程中的作用[J].中國病理生理雜志,2009,25(1)：84-88.

2 Morishima Y,Gotoh Y,Zieg J,et al.Beta-amyloid induces neuronal apoptosis via a mechanism that involves the c-J un N-terminal dinase pathway and the induction of Fas Ligand[J].J Neuosci,2001,21(19)：7551-7560.

3 Zarbock A,Schmolke M,Spieker T,et al.Acute uremia but not renal inflammation attenuates aseptic acute lung injury：A critical role for uremic neutrophils[J].J Am Soc Nephrol,2006,17(11)：3124-3131.

4 Bemardi P,Scorrano L,Colonna R,et al.Mitochondria and cell death.Mechanistic aspects and methodological issues[J].Eur J Biochem,1999,264(3)：687-701.

5 王亞利,宋天保,路明,等.Aβ25-35誘導PC-12細胞凋亡建立阿爾茨海默病細胞模型[J].西安醫科大學學報,2002,23(2)：129-132.