SPR生物傳感器在急性白血病髓系抗原CD33檢測中的應用*

謝永紅,王耀玲,程小麗,張 瑋,王紅理,方湘怡*

1.西安交通大學理學院實驗物理中心,西安 710049;2.西安市第二人民醫院婦產科,西安 710049;3.西安交通大學第一附屬醫院,血液學研究中心,西安 710049

SPR技術是一種新興的生化檢測技術。自從上世紀 80年代 Nylander和 Liedberg等將其引入到氣體檢測和生物傳感器領域中[1-3]以來,經過 20多年的發展,SPR傳感技術由于其靈敏度高、反應快速、可重復性好、樣品無需標記、操作簡單等優點[4],已被廣泛應用于臨床醫學、環境監測、藥品篩選等領域[5-7]。

白血病是一種起源于造血干細胞的惡性腫瘤,在我國已被列為十大高發性惡性腫瘤之一。我國白血病的發病率約為 3/10萬 ～4/10萬人口[8],其中急性白血病發病急、發展快、死亡率高。因此,及早地診斷白血病具有非常重大的意義。CD33是一種急性白血病髓系抗原。有關白血病免疫分型的研究資料表明：90%急性髓系白血病(AML)患者的髓系腫瘤細胞表面都表達 CD33抗原,而這種抗原在正常造血干細胞及非造血細胞表面不表達,這些發現說明 CD33抗原可能是 AML特異性診斷和治療的最佳靶抗原[9-10]。目前,對于 CD33抗原的檢測應用最廣泛的方法是流式細胞術(FCM),但是這種方法需要特殊儀器,操作技術要求高,價格昂貴,結果的重復性欠佳。

本實驗采用自組裝單層膜技術,在傳感芯片表面修飾抗 CD33單克隆抗體,首次運用自行構建的Kretschmann結構波長調制型 SPR生物傳感器檢測AML患者骨髓血液和健康人骨髓血液中 CD33抗原的表達,并將實驗結果和 FCM結果進行比較,結果顯示 SPR生物傳感器能夠很好的檢測出人骨髓液中 CD33抗原的表達。本實驗還在相同的條件下,用該 SPR生物傳感器檢測了分離的骨髓血液和骨髓全血,實驗結果表明,SPR生物傳感器對 CD33抗原的特異選擇性好。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

自行構建的 Kretschmann結構波長調制型 SPR生物傳感器、KQ-100KDE型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、KYKY SBC-12型真空離子濺射儀(北京中科科儀技術發展有限責任公司)、抗 CD33單克隆抗體(Beckman Coulter Inc)、人骨髓血液樣品(西安交通大學第一附屬醫院臨床采集)、TBST溶液(由第四軍醫大學西京醫院消化病醫院生物學腫瘤實驗室提供)、MPA和 NHS(均購于美國,Alfa Aesar)、EDC(購于上海 Medpep有限公司)、牛血清蛋白(BSA)、丙酮、無水乙醇、丙三醇等。實驗所用試劑均為分析純,所用水均為二次去離子水,所用緩沖液為磷酸鹽溶液(PBS,pH 7.4)。

1.2 實驗方法

1.2.1 SPR生物傳感器的原理

本實驗用的 SPR生物傳感器基于Kretschmann-Raether衰減全反射配置[11],采用固定入射角,在一定波長范圍(400 nm～740 nm)內對共振波長進行測量。其檢測方法是通過待測物和修飾在傳感芯片表面的生物分子反應,引起與芯片金膜接觸的介質的介電常數的變化,從而引起共振波長的改變來反映分析物的生物反應過程和性質[12]。

1.2.2 傳感片的制作

本文選用穩定性好的金膜作為傳感膜,折射率與棱鏡相匹配的玻璃片作為基片。將基片分別用去離子水、丙酮、無水乙醇、去離子水各超聲清洗 10 min,然后用氮氣吹干。再將處理好的基片放入 KYKY SBC-12型真空離子濺射儀的真空腔襯底座上,先鍍一層鉻(厚度約為 2 nm)以增強金原子的粘附力,使金膜不容易脫落,再鍍一層金膜(厚度為 50 nm)。

1.2.3 CD33單克隆抗體的固定

將傳感片浸入 0.1%(m/m)MPA的無水乙醇溶液中,于室溫下放置 12 h,取出后依次用無水乙醇和二次去離子水清洗以除去沒有吸附的 MPA;再將0.4mol/L的 EDC溶液和 0.1 mol/L的 NHS溶液按1∶1(V/V)的比例混合,滴于傳感片的金膜上,于35℃下放置1 h后用二次去離子水洗去未鍵合的混合溶液;然后在已活化的金膜上滴上抗 CD33單克隆抗體溶液(該溶液已用 PBS緩沖液按 1∶300的比例稀釋)于 37℃下放置 1 h,用 PBS緩沖液洗去未吸附的CD33單克隆抗體;最后將 BSA溶液(1 mg/mL)滴于金膜上,于 35℃下放置 40min以封閉殘余的巰基,減少非特異性吸附,然后用 PBS緩沖液洗去未吸附的BSA溶液,氮氣吹干,并將已修飾好 CD33單克隆抗體的傳感片置于 4℃冰箱中保存備用。

1.2.4 用 SPR生物傳感器檢測樣品

將已經修飾了抗 CD33單克隆抗體的傳感片用折射率相匹配的丙三醇耦合在棱鏡上,調節光路并采集黑、白對照光譜圖,在樣品池中加入 100μL PBS緩沖液,記錄光譜圖 1,然后再在樣品池中加入100μL的待測骨髓血液樣品,保持 1 h使抗體-抗原充分反應,然后用 TBST溶液沖洗傳感片,以減少非特異性吸附,然后再用 PBS緩沖液沖洗,記錄光譜圖 2,分析上述光譜圖,就可以得到抗原-抗體結合后共振波長的變化值。整個 SPR實驗都是在 25℃的溫度條件下進行,樣品加入前后的光譜圖均在以PBS緩沖液為環境液體的條件下測得。這樣可以有效地減少其他因素對實驗結果的干擾。

圖1 MPA自組裝(a)、抗 CD33單克隆抗體的固定(b)、陰性對照(c)、陽性對照(d)的 SPR光譜圖

1.2.5 傳感片的再生

傳感片的再生就是用一定濃度的酸、堿溶液或者離子試劑,破壞抗體-抗原之間的結合,使抗體-抗原離解。本實驗采用 Piranha試劑(濃 H2SO4和 30%H2O2按體積比 3∶1混合,該溶液具有強氧化性,每次少量配置)作為洗脫液滴于傳感片金膜表面,每次反應 3min,然后用二次去離子水清洗,并用氮氣吹干,如此重復洗3次,能有效地洗脫傳感片表面吸附的所有抗體及其免疫復合物,實現傳感片的再生。

2 結果與分析

2.1 抗CD33單克隆抗體的固定和抗原-抗體反應

將生物分子固定在傳感片表面的方法有很多[13]。本實驗采用的是自組裝膜技術,先在金膜表面自組裝一層巰基單分子膜,然后通過EDC和NHS混合溶液的活化作用生成 NHS活潑脂中間體,將抗 CD33單克隆抗體分子牢固地固定在金膜表面。以 AML患者骨髓血液作為陽性對照組,健康人骨髓血液作為陰性對照組,圖1顯示的是所測得的 SPR光譜圖。

比較光譜曲線 a和 b的峰值,我們可以看到共振波長明顯增大了。這是因為金膜表面附近介質的折射率發生了變化,而介質折射率的改變又與固定在金膜表面的抗體分子有關。曲線 a和 b之間的共振波長之差說明抗 CD33單克隆抗體已經很好地固定在金膜上了。再比較曲線 b,c和 d,我們可以看到：與曲線 b的共振波長相比,曲線 c的共振波長的增長幅度明顯小于曲線 d的共振波長的增長幅度,其中 δλcb為1.601 nm,δλdb為 18.10 nm。這與抗原-抗體反應的特異性相符合。實驗結果表明該 SPR傳感器能很好的檢測出樣品骨髓液中 CD33抗原的表達情況。

2.2 SPR生物傳感器對CD33抗原的特異選擇性

骨髓全血是從 AML患者身上采集的骨髓血液,沒有經過分離,它除了含有表達 CD33抗原的細胞之外,還含有其他蛋白質分子以及脂類分子等,成分十分復雜,而經過分離的骨髓血液的成分則相對簡單。本實驗在相同條件下檢測了 AML患者骨髓全血和經過分離的骨髓血液,以此研究 SPR生物傳感器對 CD33抗原的特異選擇性。

在其他實驗條件相同的前提下,用上述檢測方法對 AML患者骨髓全血和經過分離的骨髓血液進行檢測,結果如表 1所示。

表1 SPR生物傳感器對不同類型的骨髓血液的響應值

從表 1的結果可以看出,SPR生物傳感器對上述兩種類型骨髓血液的響應值基本一致。這表明,其他蛋白質分子對檢測結果的干擾很小,SPR生物傳感器對 CD33抗原具有良好的特異選擇性。

2.3 SPR結果和FCM結果的比較

本實驗用 SPR生物傳感器檢測了幾組樣品,并將結果與西安交通大學第一附屬醫院的流式細胞術結果相比較。圖 2顯示的是 SPR方法與 FCM方法檢測的結果。

比較圖 2(A)和(C)中的曲線 a,b可得待樣品溶液充分反應后共振波長的增長值分別為 16.865 nm和 1.027 nm。對照陰性實驗組和陽性實驗組,判斷(A)中的樣品 1為陽性,即為 AML病人骨髓液,(C)中的樣品 2為陰性,即為健康人骨髓液。比較此結果和流式細胞術的結果,兩者一致。

圖2 SPR結果與 FCM結果的比較。(A)和(B),(C)和(D)分別表示樣品 1和樣品 2的SPR譜和FCM圖。其中,(A)和(C)中的曲線 a為修飾了抗 CD 33單克隆抗體的傳感芯片的 SPR譜,曲線 b為樣品的 SPR譜

為了進一步驗證 SPR方法的可行性和準確性,本實驗檢測了由西安交通大學第一附屬醫院血液學研究中心提供的臨床診斷為 AML病人的骨髓液和健康人的骨髓液,結果如圖 3所示。其中 No.1,3～6,8～10,12,13,15,16,18～20為 AML病人骨髓液,No.2,7,11,14,17,21,22為健康人骨髓液。

從圖 3的檢測結果來看,AML病人骨髓液的共振波長增長值遠遠大于健康人骨髓液的共振波長增長值,其中,該 SPR生物傳感器對 AML患者和健康人骨髓血液中 CD33抗原的最大響應值分別為 20.637 nm和 3.402 nm。其結果均與流式細胞術的結果相符。從圖 3中我們也可以看到,盡管都是 AML病人骨髓液,但是它們的共振峰移動幅度卻不相同,究其原因,可能與白血病的高度異質性和異源性有關。

圖3 22個樣品的SPR檢測結果柱形圖。樣品1,3～6,8～10,12,13,15,16,18～20為 AML患者的骨髓液,樣品 2,7,11,14,17,21,22為健康人骨髓液

3 結論

本實驗首次運用 SPR生物傳感器,在傳感芯片表面固定抗 CD33單克隆抗體,以健康人骨髓血液為陰性對照組,已知屬性的 AML患者骨髓血液為陽性對照組,檢測人骨髓血液中急性白血病髓系抗原CD33的表達。結果顯示 SPR生物傳感器能很好地檢測出樣品血液中 CD33的表達差異。同時,實驗表明 SPR生物傳感器對 CD33抗原的特異選擇性好。與傳統的 FCM方法相比,SPR生物傳感器還具有操作簡單、樣品無需標記、靈敏度高、能夠快速給出定量結果的優點,因此 SPR生物傳感器在急性白血病髓系抗原 CD33的檢測中有著廣闊的應用前景。同時,該實驗也為 SPR生物傳感器在白血病的臨床診斷中的應用研究提供了新思路。

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