Ⅱ型豬圓環病毒Cap蛋白多克隆抗體的制備與鑒定

王 卓，盧玉婷，魏 雪，張海斌，柯玉花，苗麗娟

（吉林農業科技學院，吉林 吉林 132101）

豬圓環病毒（PCV）是迄今發現的一種最小的動物病毒。現已知PCV有兩個血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性的病毒，PCV2為致病性的病毒。PCV2是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）的主要病原，并多發于5～16周齡的豬。該病最早發現于加拿大，很快在歐美及亞洲一些國家包括我國發生和流行，除PMWS外，豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、增生性壞死性肺炎（PNP）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關聯。PCV2及其相關的豬病，死亡率達10%～30%，較嚴重的豬場在暴發本病時死淘率高達40%，給養豬業造成嚴重的經濟損失。現已被世界各國的獸醫與養豬業者公認為是繼豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）之后新發現的引起豬攻毒障礙的重要傳染病。

本試驗利用制備好的原核表達的PCV2 Cap蛋白，免疫Balb/c鼠，制備Ⅱ型豬圓環病毒Cap蛋白的多克隆抗體，根據其抗體產生情況分析其抗體產生規律，生產出的多抗可以作為標準陽性血清用于酶聯免疫吸附試驗等，且在制備多抗過程中檢測出抗體產生的規律，為制備圓環病毒的單克隆免疫程序奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PCV2 Cap蛋白由吉林農業科技學院實驗室保存。蒸餾水、弗氏佐劑、PBS為國產試劑。雌性Balb/c鼠購自哈爾濱獸醫研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物免疫試驗

將雌性Balb/c鼠6只隨機分為對照組和試驗組，每組3只。第1次免疫將定量的純化好的PCV2 Cap蛋白與等體積的完全弗氏佐劑混合并完全乳化后，小鼠腹腔注射0.5mL·只-1；間隔15 d進行第2次免疫，佐劑用弗氏不完全佐劑，免疫方法和劑量同上；再間隔15 d后進行第3次免疫，佐劑用弗氏不完全佐劑，免疫方法和劑量同上。每次免疫后第3、7、10天采血，第3次免后的第10天采取小鼠眼球采血。對照組采用PBS免疫，免疫方法和劑量同免疫組。

1.2.2 抗血清制備方法

采取小鼠尾部或眼球血液，37℃1 h，4℃過夜，1 500 rpm離心5min，吸取上層血清，-80℃分裝保存。

1.2.3 間接ELISA方法測定抗體效價

采用間接ELISA方法檢測抗體效價，以純化出的Cap蛋白為抗原，檢測制備出的多克隆抗體效價，純化后的融合蛋白按200 ng·孔-1包被酶標板，以對照組血清為陰性對照，將免疫血清和陰性血清同時作1∶100稀釋后，用間接ELISA檢測抗體OD值，具體步驟如下。將最后一次眼球采血中的待檢血清按照1∶100、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800及1∶25 600稀釋后，用間接ELISA檢測抗體效價。

每孔加入100μL以碳酸鹽緩沖液稀釋的Cap蛋白抗原（終濃度為2μg·mL-1）包被96孔酶標板，4℃過夜，PBST洗3次后進行封閉；每孔加封閉液100μL（5%脫脂乳），37℃放置1 h后，PBST洗3次；每孔加100μL以PBST梯度稀釋的被檢血清，37℃放置1 h，PBST洗3次；每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG抗體（1∶5 000稀釋）100μL，37℃放置1 h，PBST洗3次；每孔加入新配制的OPD顯色溶液100μL，置暗盒中10～20min后，每孔加入50 μL終止液（2mol·L-1H2SO4）終止反應。

1.2.4 結果判定

將96孔酶標板置于酶標儀492 nm處，測定每孔的OD值，結果以P/N≥2.1判定為陽性。

1.2.5 多克隆抗體的鑒定

將純化的PCV2 Cap蛋白經SDS-PAGE電泳后，經BG-trans BLOT迷你轉移芯濕轉2 h，將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳4℃封閉過夜。PBST洗5次，用添加0.1%～0.2%的Tween-20封閉液1:100稀釋制備的鼠血清和陰性血清，37℃2 h。PBST洗5次，浸入含0.1%～0.2%的Tween-20封閉液1∶5 000稀釋的紅外染料標記羊抗鼠熒光二抗（避光），37℃放置1 h，PBST洗滌 5次（避光），用PBS再洗滌2次去膜上殘留的Tween-20（避光），用Odyssey紅外成像系統進行掃描。

2 試驗結果

2.1 抗體檢測結果

抗體檢測結果見表1。

表1 抗體檢測結果

由表1可知，第1次免疫后第3、7、10天采血的3只老鼠的抗體陽性與陰性比值（P/N）是分別為1.5、1.8、2.1，1.9、1.6、2.1，1.6、1.7、2.1；第2次免疫后第3、7、10天采血的3只老鼠的抗體P/N是 2.3、2.9、3.7，2.3、2.7、3.6，2.3、2.8、3.6；第3次免疫后第3、7、10天采血3只老鼠的抗體P/N 為 3.9、 4.6、 4.6， 3.4、 4.7、 4.9， 3.6、 4.6、4.7。結果表明，在第1次免疫后第10天的抗體P/N≥2.1，說明第1次免疫后第10天的血清可以作為陽性血清。

2.2 多克隆抗體效價的測定

多克隆抗體效價的測定結果見表2。

表2 不同血清稀釋倍數的多克隆抗體效價

由表2可知，小鼠最后采血測定其血清效價，結果表明，其抗體效價為1∶12 800（P/N＞2.1）。

2.3 抗體產生規律

小鼠第1次免疫后10 d開始產生抗體P/N＞2.1，第2次免疫后抗體水平明顯升高，第3次免疫第7～10天后抗體水平基本不變。

2.4 Western blot檢測結果

Western blot檢測結果見附圖。

附圖 應用純化的蛋白對多抗進行鑒定的結果

由附圖可知，在26kDa附近出現單一的條帶，說明制備的鼠多抗是目的蛋白誘導產生的特異性抗體。

3 討論

抗原和抗體是免疫學檢驗的兩大重要因素，也是整個免疫反應的基本條件。抗體是機體在抗原刺激下所產生的特異性球蛋白。特異性抗體是免疫應答中的重要產物，也是免疫學實驗中常用的試劑，對于抗原的分析鑒定和定量檢測極為重要，在各種免疫學診斷中應用極為廣泛。

目前人工制備的特異性抗體分為多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。單克隆抗體用雜交瘤技術制備，近年來又出現了基因工程抗體（單鏈抗體），多克隆抗體存在于免疫動物抗血清中[1]。前者生產成本高、周期長，實驗技術要求高，故本研究選擇制備多克隆抗體，更主要是為單克隆抗體制備的免疫程序奠定試驗基礎。

制備高效價、高特異性的免疫血清必須有理想的免疫原、挑選適合的動物。蛋白質是良好的抗原，本實驗制備的PCV2 Cap融合蛋白已經親和層析法純化，達到7.29mg·mL-1可作為免疫原免疫小鼠，制備抗血清[2-3]。

4 小 結

本試驗制備的Ⅱ型豬圓環病毒Cap蛋白多克隆抗體效價達到1∶12 800，制備的抗體產生規律是第1次免疫小鼠后第10天開始產生陽性抗體，第2次免疫后抗體水平明顯升高，第3次免疫后第7～10天抗體水平基本保持不變。

[1]苗麗娟.豬圓環病毒檢測方法的研究進展[J].飼料博覽,2011（2）:49-51.

[2]苗麗娟,符芳,王小武,等.豬圓環病毒2型去核定位信號ORF2基因的原核表達與初步應用[J].中國預防獸醫學報,2008（5）:26-29.

[3]應用RNAi技術抑制豬圓環病毒2型的復制和表達豬圓環病毒2型衣殼蛋白的桿狀病毒的免疫保護作用[D].揚州:揚州大學,2008.