牛血液中及蜱吸血后血液中牛瑟氏泰勒蟲基因組DNA含量及同源性比較

呂 舟

（吉林農業科技學院動物醫學學院，吉林 吉林 132000）

牛瑟氏泰勒蟲病是由泰勒科、泰勒屬的瑟氏泰勒蟲（Theileria.sergenti）寄生于牛體內引起的以高熱、貧血、出血、消瘦和體表淋巴結腫大為主要臨床癥狀的一種血液原蟲病[1－2]。該病呈世界性分布，我國東北、西北、華北、華南等地區牛瑟氏泰勒蟲感染情況較嚴重[3－7]。近年來，隨著養牛業的發展，牛瑟氏泰勒蟲病的發生呈上升趨勢勢尤其是引進牛和改良牛的發病率和致死率均較高，已成為嚴重威脅養牛業健康發展的重要疾病之一。

硬蜱（Ixoaldae）是家畜多種傳染病和寄生蟲病的傳播者，特別對家畜血孢子蟲病病原的傳播起著重要作用[8]。該蟲體寄生于牛、羊體表，吸食血液，引起家畜消瘦，更為嚴重的是，蜱是焦蟲病、立克次氏體病等的傳播者[9]。其中硬蜱隸屬硬蜱科血蜱屬的長角血蜱為牛瑟氏泰勒蟲的傳播媒介[10]。通過叮咬，將病牛的感染紅細胞吸入，經蜱體內發育，再叮咬時，將正在分裂的焦蟲注人另一宿主（病牛）體內，并繼續吸入感染的紅細胞[11]。針對蜱這一傳播媒介，本試驗對其DNA含量進行了分析，比較其與牛瑟氏泰勒蟲基因組DNA含量及P33表面蛋白基因同源性，進一步證明其傳播途徑及確定含量關系，為焦蟲病、立克次氏體病等病基因組DNA的提取提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 病料及主要試劑

在牛瑟氏泰勒蟲病的高峰期6～7月，于吉林省延邊州琿春市某牧場采集樣本。牛抗凝液及吸血后蜱對應在同一頭牛身上被采集，每頭做標記。DNA提取試劑盒、exTaq酶等均購自TaKaRa公司，其他試劑為分析純。

1.2 涂片的制備

取血液樣本涂片、自然干燥，滴加甲醇2～3滴，固定2～3min。將固定片浸于盛有姬姆薩染色液的染缸中染30min，然后水洗、干燥、顯微鏡觀察。

1.3 引物的設計與合成

據GenBank（AF521557.1）上發表的牛瑟氏泰勒蟲P33表面蛋白基因序列，應用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設計特異性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為：P1：5－atgttgtccaagaaatcgtt－3′ ，P2：5－cagtattctactatctctag－3 ′，PCR擴增產物長度為852 bp。

1.4 牛瑟氏泰勒蟲基因組DNA的提取及目的片段擴增

用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以其為模板，采用25μL PCR反應體系：10×PCR buffer 2.5μL， dNTP 2μL，P1、P2引物各1μL，模板DNA 2 μL，exTaq酶 0.25 μL，dH2O 16.25 μL。PCR反應條件為35個循環，94℃預變性5min，94℃ 45 s，55℃ 1min，72℃ 1min，72℃ 延伸10min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 紫外分光光度計法測DNA含量

將樣品進行50倍稀釋后，應用紫外分光光度計，在波長為260及280 nm下調零，并測定其OD值，依據測定結果計算其DNA濃度含量。

計算公式見式（1）

注：濃度單位為μg·mL－1。

1.6 同源性比較

將鑒定正確的PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序，通過軟件DNAMAN，對GenBank上登錄的基因序列與牛瑟氏泰勒蟲延邊州分離株的兩個樣本的核苷酸序列進行同源性分析。

2 結 果

2.1 涂片鏡檢的結果

涂片鏡檢結果見圖1。

圖1 姬姆薩染色涂片鏡檢結果

由圖1可見，鏡檢發現兩種血液樣本中紅細胞形狀大小不一，紅細胞內有小型蟲體，呈梨籽形和逗點形等形狀，A圖中蟲體的染蟲率約為15%，B圖蟲體的染蟲率約為4%。可見蜱吸血后血液中牛瑟斯泰勒蟲明顯高于牛血液中染蟲率。

2.2 PCR擴增結果

以兩種牛瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模板，P1、P2為引物，經PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR擴增結果見圖2。

由圖2可見，在852 bp擴增出特異性條帶，并可明顯看出蜱吸血后血液擴增條帶比牛血液擴增條帶清楚得多。與預期結果相一致。

圖2 PCR鑒定結果

2.3 紫外分光光度計法測DNA含量

透過紫外分光光度計測量后，經公式計算，結果在蜱吸血后血液DNA濃度為127 ug·mL－1，而牛血液中DNA濃度僅為52 ug·mL－1。結果顯示蜱吸血后血液DNA濃度明顯高于血液中DNA濃度。

2.4 同源性比較

測序結果表明，牛血液中和蜱吸血后血液中該基因序列同源性為100%。兩者與GenBank上已發表的序列同源性為99%，由此可見該基因在蜱吸血后血液中和牛血液中具有相同的序列，進一步證明蜱是牛瑟氏泰勒蟲病的傳播媒介。

3 討論

近年來，隨著我國養牛業的發展和牛只的頻繁運輸，瑟氏泰勒蟲病的發生呈上升趨勢，且疫區發病率和致死率均較高，給畜牧業帶來了較大的經濟損失，引起了國內外獸醫界的廣泛關注。因此對瑟氏泰勒蟲病的研究已迫在眉睫。蜱是瑟氏泰勒蟲是傳播媒介，已知能傳播瑟氏泰勒蟲蜱有長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）、嗜群血蜱（H.concinna）和日本血蜱（H.japonica）3種，我國主要是長角血蜱。

DNA是主要的遺傳物質，而遺傳物質的基本功能是遺傳信息的傳遞和表達，所以對DNA的來源及含量的測定有著極其重要的意義。本試驗通過DNA試劑盒在牛血液中和蜱吸血后血液中分別提取出基因組DNA，通過DNA試劑盒法替代傳統的乙醇沉淀法提取基因組DNA，可得到高質量的不含苯酚、氯仿、乙醇等化學試劑的基因組DNA，并盡可能避免在傳統乙醇沉淀過程中因DNA沉淀不完全而導致的DNA損耗，獲取最大量的基因組DNA。

通過姬姆薩染色法、PCR鑒定、紫外分光光度計法可初步判定蜱吸血后血液中基因組DNA要明顯高于牛血液。測序結果表明，牛血液中和蜱吸血后血液中該基因序列同源性為100%。兩者所得序列經BLAST對GenBank數據庫中已發表的牛瑟氏泰勒蟲P33主要表面蛋白基因序列進行同源性分析，結果為99.0%，這表明所擴增產物是P33蛋白基因序列，與預期結果相符。進一步證明蜱是牛瑟氏泰勒蟲病的傳播媒介。為今后牛瑟氏泰勒蟲病的研究及對蜱這一傳播媒介的深入探討提供理論依據。

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